用primer express软件来设计比较方便

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1、用PrimerExpress软件来设计比较方便、简单。网上搜索一下，我记得有网友提供的。如果实在找不到这个软件的话，可以参考下面的指南。先设计好Probe，再设计Primer。goodluck。DesignGuidelinesEnsurethefollowingguidelinesaremet：    ×Ampliconlength–50to150basesforoptimumPCRefficiency.    ×  ProbeLength–13to30bases.Donotoverlapprimerandprobesequences.    ×  Tm–68to70°C.    ×  %GC

2、–30to80%.    ×  5'end–CannotbeaGresidue.AGresidueadjacenttothereporterdyewillquenchthereporter        fluorescencesomewhat,evenaftercleavage.Avoidthefollowingmotifs：    ×  Repeatingoligonucleotides–Avoidrunsofidenticalnucleotides.Ifrepeatsarepresent,theremustbe        fewerthanfourconsecutiveGresidu

3、es.    ×  ConsecutiveAresidues–AvoidsixconsecutiveAresiduesanywhereintheprobe.ConsecutiveA        residuescancauseahighNoTemplateControl(NTC)signal.    ×  CCdinucleotides–AvoidtwoormoreCCdinucleotidesinthemiddleoftheprobe,whichcansometimes        reducesignal.Selectadifferentprobeordesigntheprobeusi

4、ngtheanti-sense(complementary)strand.    ×  FAM™dye-labeledprobes–IfyouwillorderaFAMdye-labeledprobe,avoidaGinthesecondpositiononthe5'end(VIC®dye-labeledprobesarenotaffected).AGinthesecondpositiononthe5'endinFAMdye-labeledprobescanreducefluorescentnormalizedreportersignal(Rn).      ×  HairpinLoops,s

5、elf-dimerization,andcross-dimerization.DesignConsiderationsWhenSelectingCandidateProbes：      ×  SelectprobeswithmoreCresiduesthanGresiduestominimizereporterfluorescencequenching.      ×  SelectprobeswithTm10°CormorehigherthantheprimerTm.定量PCRTaqman探针设计要领自90年代Taqman探针诞生以来，虽然荧光探针（引物）不断有新的技术出现，但是作为一种经

6、典的定量PCR技术，Taqman探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选，这主要是因为相对于SYBR荧光染料，Taqman探针具有序列特异性，只结合到互补区，而且荧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系，因此特异性强灵敏度高，而且条件优化容易；而相对于杂交探针，Taqman探针只要设计一条探针，因此探针设计较便宜方便，而且也能完成基本的定量PCR要求。当然Taqman定量方法由于还是要合成探针，也给实验操作带来了挑战。一般Taqman定量PCR实验过程为：目的基因查找比对→探针与引物设计→探针与引物合成→配置反应体系→反应参数→重复实验，优化条件→获得曲线数据，比对标准曲线→再重复验证

7、。　第一步：在第一步目的基因查找比对过程中可以利用NCBIgenbank序列以及DNAstar等软件完成目的DNA或者RNA的查找与比对——这在分析测序报告的时候相信很多人操作过，这一步需要注意的就是要保证所分析的序列在一个contig（重叠群，即染色体的一些区域中毗邻DNA片段重叠的情况）内。　第二步：如果其它条件一致，那么这个第二步——引物探针的设计就可以说是定量PCR成败的关键了，通过各方面