2、错配,二聚体,产生错的产物即可。最后在引物的5'端添加酶切位点以及保护碱基。具体操作打开PrimerPremier5FileNewDNASequence选项AS is- OK 点击primer 按钮,弹出菜单后点击search按钮选择PCRprimer,Pairs参数,并选择所需PCR产物长度,OK会弹出搜索结果菜单,点击OK在搜索出的结果列表里选择TM合适、GC含量高、无各种BUG的引物,点击editprimer,将所得引物复制而后点击S/A按钮,并继续点击editprimer,复制反向引物,引物设计达成。得到3'端GAAGTTCCAAGGTCGTTA5'端TCGTGGGCAGATTTAT