使用oligo 6和primer premier 5.0等软件设计pcr引物

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1、使用Oligo6和PrimerPremier5.0等软件设计PCR引物张新宇（中国医科院肿瘤研究所，北京100021）电子邮件:zhangxy@pubem.cicams.ac.cn在当今分子生物学研究中，PCR技术已成为使用最多，最广泛的技术之一。而引物设计是PCR技术中至关重要的一环。在PCR扩增以前，一般模板序列已被全部或部分确定。要想扩增出理想的目的片断，一般都得通过正确设计PCR引物。也有的人不经过设计直接取模板序列的两个片段作为引物，这样很可能导致实验失败，如扩增出多条带（引发错配所致），不

2、出目的带或出目的带很弱（引物引发效率低下），引物二聚体带（引物与引物之间形成稳定二聚体）等等。现在PCR引物设计都通过计算机软件进行。生物信息学发展至今日，具有引物设计功能的软件有很多，其中大部分是免费软件，可直接从网上下载，安装并运行。这类软件大都简单易用，但其引物设计功能一般不很强，通过它们设计的引物常常不尽如人意，而专门进行引物设计的商业版软件功能强大，但使用起来不太容易。本文就这一问题进行探讨。引物设计的原则引物设计有几条基本原则：首先引物要跟模板紧密结合，其次引物与引物之间不能有稳定的二聚体

3、或发夹结构存在，再次引物不能在别的非目的位点引起DNA聚合反应(即错配)。围绕这几条基本原则，设计引物需要考虑诸多因素，如引物长度（primerlength），产物长度（productlength），序列Tm值(meltingtemperature)，ΔG值(internalstability)，引物二聚体及发夹结构（duplexformationandhairpin），错误引发位点（falseprimingsite），引物及产物GC含量（composition），有时还要对引物进行修饰，如增加限制酶

4、切点，引进突变等。以使用Oligo软件分析设计引物为例，笔者总结出以下的要点：1.引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，即Taq酶的最适温度。2.引物3’端的序列要比5’端重要。引物3’端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高。另外引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不大，因此常用来引进修饰位点或标记物。3.引物的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反

5、应。上下游引物的GC含量不能相差太大。4.引物所对应模板序列的Tm值最好在72℃左右。5.ΔG值(自由能)反映了引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的ΔG值最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间ΔG值较高，而3’端ΔG值相对较低，且不要超过9（ΔG值为负值，这里取绝对值），如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。6.可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成的相似性，相似性高则错误引发率高，错误引发的引发率一般不要高过100，如此可保证不出非目的产物的假带。7.8引物二聚体及发夹结构的能量

6、一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓度从而导致PCR正常反应不能进行，与二聚体相关的一个参数是碱基的分布，3’端的连续GGG或CCC会导致错误引发。1.对引物的修饰一般是增加酶切位点，应参考载体的限制酶识别序列确定，常常对上下游引物修饰的序列选用不同限制酶的识别序列，以有利于以后的工作。值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件较差，比如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；有时PCR产物要作为克隆对象插入到载体中表达，因此PCR引物设计的可选

7、择度很低。遇到这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件，这时，使用自动搜索引物及正确地评价引物可使研究人员对实验心中有数。引物的自动搜索和评价分析带有引物设计功能的软件有很多，大都是ForWindows版本的。在此特别推荐两个专门性的引物设计软件（商业版）：PrimerPremier5（以下简称Premier）和Oligo5.0/6.22软件的引物设计功能主要体现在两个方面，首先是引物分析评价功能，该功能只有少数商业版软件能够做到，其中以Oligo软件最优秀；其次是引物的自动搜索功能，各种软件在这方面的

8、侧重点不同，因此自动搜索的结果也不尽相同。据笔者的经验，自动搜索功能以Premier为最强且方便易用，Oligo软件其次，其他软件如VectorNTISuit,Dnasis,Omiga,Dnastar都带有引物自动搜索功能，但搜索结果不是十分理想。当然要想保证得到效果理想的引物，在自动搜索的基础上，还要对引物辅以人工分析，以得到最佳设计的引物。因此，笔者认为引物设计软件的最佳搭配是Oligo和Premier软件一起，以Premier进行自动搜索，Olig