人41bbl胞外区-抗cd20融合蛋白的构建和表达

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1、人41BBL胞外区/抗CD20融合蛋白的构建和表达：刘荣,姜文国,刘芳,张砚君,范冬梅,杨铭,熊冬生,杨纯正【摘要】　　目的:构建和表达人41BBL胞外区/抗CD20双功能融合蛋白,并测定该融合蛋白的生物学活性。方法:采用PCR和ovelapPCR方法构建人41BBL胞外区/抗CD20双功能融合蛋白,并用双脱氧终止法测定DNA序列;采用亲和层析法纯化该产物,并用150g/LSDSPAGE和:Toconstructandexpresshuman41BBL/antiCD20bispecific

2、fusionproteinandidentifyitsbiologicalactivity.METHODS:PCRandoverlappingPCRan41BBL/antiCD20bispecificfusionprotein.DNAsequencingedbytheterminusofthefusionproteinnucleotide.TheproductatographyandanalyzedbyI1640（GibcoBRL）,表达载体pAYZ41BBL和pAYZFCD20由本室构建保存,

3、TaqDNA聚合酶、PfuDNA聚合酶购自上海申博生物公司,限制性内切酶MluI,NheI,SphI均购自大连宝生物公司,T4DNA连接酶购自Invitrogen公司,鼠抗Etag抗体,HRP标记的鼠抗Etag抗体及抗Etag亲和层析柱均购自Pharmacia公司,其他均为国产分析纯生化试剂。PCR引物:P15′CGCATTTCTTCTTGCATCTA3′,P25′GCGGAGAGAGCCACCTCCGCCCCGTTTCAGCTCCAGCTTGGTC3′,P35′GGCGGAGGTGG

4、CTCTCTCCGCGAGGGTCCCGAGC3′,P45′GCGCGCTAGCTTATTCCGACCTCGGTGAAGGGAG3′(NheI),P55′GCGCGCTAGCACGTAAAAAGGGTATCTAGAG3′(NheI),P65′GCGGAGAGAGCCACCTCCGCCTGAGGAGACGGTGACCGTGA3′,P75′GATAAGCTGTCAAACATGAG3′。下画线为括号内的限制性内切酶位点。　　1．2方法　　1．2．1DNA的酶切、连接、转化等常规分子生物学操

5、作参照文献［5］进行。　　1．2．2人41BBL胞外区/抗CD20融合蛋白表达载体的构建利用PCR法从抗CD20(Fab’)2和人41BBL胞外区表达载体上分别采用P1、P2,P3、P4,P5、P6,P3、P7扩增CD20VL,CD20VH,41BBL胞外区,41BBL胞外区Etag基因,经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后,利用overlapPCR,以G4S作为连接肽,分别将CD20VL与41BBL胞外区,CD20VH与41BBL胞外区Etag连接形成DNA片段CD20VL41BBL胞外

6、区、CD3VH41BBL胞外区Etag。经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后,DNA片段CD20VL41BBL胞外区用MluI+NheI消化,DNA片段CD3VH41BBL胞外区Etag用NheI+SphI消化,并与经MluI+SphI消化的表达载体pAYZ连接,形成人41BBL胞外区/抗CD20融合蛋白表达载体pAYZDBC。　　1．2．3人41BBL胞外区/抗CD20融合蛋白的高效表达将载体pAYZDBC转化E.coli16C9,挑取单菌落接种于含氨苄青霉素(0.1g/L)的2YT培

7、养基（16g/L胰蛋白胨,10g/L酵母提取物,5g/LNaCl）中,37℃振荡培养8h后,按1∶2的比例转接于含氨苄青霉素(0.1g/L)的Ap5培养基（1.5g/L葡萄糖,11g/L酸水解酪蛋白,0.6g/L酵母提取物,0.19g/LMgSO4,1.07g/LNH4Cl,3.73g/LKCl,1.2g/LNaCl,0.12mol/L三乙醇胺pH7.4）中,25℃振荡培养24h,4℃离心收集菌体,将菌体于-20℃冻存1h后,化冻后加入细菌周质腔提取液（三羟甲基氨基甲烷25mmol/L,乙二胺四乙酸1

8、mmol/L,苯甲基磺酰氟（PMSF）0.1mmol/L,蔗糖200g/L（ES,1mmol/LEDTA）（pH7.0）平衡和ElutionBuffer（0.1mmol/L甘氨酸）（pH3.0）洗脱,FPLC收集洗脱峰。150g/LSDSPAGE及RNA,并在该mRNA的2个含有SD序列的位置合成相应的多肽链,在引导肽stII的作用下分泌到细菌周质腔,形成融合蛋白。　　图1PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳（略）　　Fig1AnalysisofPCRandr