山茱萸提取物对肾阳虚大鼠下丘脑垂体肾上腺皮质轴的影响

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1、山茱萸提取物对肾阳虚大鼠下丘脑垂体肾上腺皮质轴的影响【Abstract】ObjectiveToexploreeffectsofextraofFructusCorni(FCE)ontonifyingkidneyyang．MethodsTheanimalmodelofkidneyyangdeficiencyadebyexogenousglucocorticoid．EffectsoftheextractofFructusCornionthekidneyyangdeficiencyratsodulin(CaM)mR

2、NAandincreasethesecretionofCRHinthehypothalamus.ConclusionTheextractofFructusCornihavesignificantprotectingefficacyintheanimal’smodelodulin(CaM)，hypothalamus，corticotrophinreleasingfactor（CRH）山茱萸为山茱萸科植物山茱萸的干燥成熟果肉，含有机酸、糅质、环烯醚萜类、氨基酸和维生素等多种有效成分，它为平补阴阳的中药，有补肝益肾、收

3、敛固涩的功效。已有研究报道山茱萸可补肾阳之虚，提高肾阳虚动物生命质量［1］。为进一步探讨其补肾阳之虚药物作用机制，本实验从分子水平上观察了山茱萸提取物（extractofFructusCorni,FCE）对肾阳虚动物的下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）分泌及钙调蛋白（CaM）mRNA表达的影响。1材料与方法1.1动物成年健康雄性SD大鼠80只，雌雄各半，体重为220～280g，由滨州医学院实验动物中心提供。1.2药物获FCE的方法是乙醇提取后，浓缩，过大孔吸附树脂，收集乙醇洗脱液，减压浓缩得到稠膏，实验时稀

4、释成所需浓度，由本实验室提供。醋酸泼尼松龙注射液，仙居制药有限公司，批号010330，规格125mg/5ml。1.3造模、分组及给药采用经典的以大剂量肾上腺皮质激素造肾阳虚动物模型的方法［2］。将雄性大鼠随机分为5组，每组16只。正常空白对照组每只每日10ml／kg自来水灌胃，其余4组每只每天上午在臀部皮下注射醋酸泼尼松龙0.5ml／100g。与此同时，模型空白对照组（肾阳虚组）每只灌胃给予自来水每日10ml／kg；山茱萸小、中、大剂量组，每日每只灌胃分别给予10、5、2g／kgFCE。连续注射醋酸泼尼松龙7d后

5、，停药6d。在造模同时，连续灌胃给予自来水或药物13d。1.4下丘脑取材方法第13天，用药后2h，所有动物断头，按文献［3］方法取大鼠下丘脑，放入冻存管，立即置于液氮中固定，然后转入低温冰箱-70℃保存。1.5大鼠下丘脑CRH含量的检测采用放射免疫法测定。每组取下丘脑组织5个，称重后在生理盐水中煮沸5min以灭活酶,减少神经肽蛋白水解酶，加1ml1N乙酸匀浆,静置1h,使活性肽充分溶解；加0.8ml1N氢氧化钠中和,离心,取上清1ml,-70℃冷冻保存待测。放射免疫测定用平衡饱和加样程序，加样总反应体积300μl

6、，4℃孵育24h后,每管加分离剂500μl,混匀后室温放置45min,4000r/min离心20min,弃上清,测定沉淀的放射性核素闪烁计数值,并依照标准曲线换算为pg/mg。1.6实时荧光定量RTPCR检测CaMmRNA的表达1.6.1总RNA的提取:下丘脑组织每组各取5个，用Invitrogen公司TRIZOL试剂盒提取总RNA，按说明书操作。1.6.2引物:从GenBank中查出大鼠CaM基因和大鼠βactin的mRNA序列，利用美国PE公司引物设计软件PrimerExpress设计基因专一性引物CaM

7、上游引物是5’GATAAGGACGGCAATGGCTACA3’，下游引物是5’CGATGTCTGCTTCCCTGATCAT3’，扩增片段为115bp。βactin（内参对照）上游引物是5’CCTGTGGCATCCATGAAACTAC3’,下游引物是5’CTTCTGCATCCTGTCAGCGAT3’,扩增片段为134bp。1.6.3RTPCR1.6.3.1cDNA的合成：在50μl逆转录反应体系中进行反转录（5μlTaqManBuffer、1.25μlReverseTranscritase（1.

8、25U/μl）、1μlRnaseInhibitor（0.4U/μl）、10μldNTPmixture、11μlMgCl2（5.5mM）、2.5μlOligod(T)16（2.5μM）、5μlRNASample，于25℃孵育10min，48℃逆转录反应30min，95℃逆转录灭活5min。1.6.3.2PCR扩增：取逆转录产物5μl，加入20μl扩增反应体系（2.5μlSY