人参二醇组皂苷对人胶质瘤u251细胞增殖与凋亡的影响

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1、人参二醇组皂苷对人胶质瘤U251细胞增殖与凋亡的影响【摘要】目的观察人参二醇组皂苷（PDS）体外对U251细胞增殖及凋亡的影响。方法采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测不同浓度PDS对U251细胞增殖活力的影响；吖啶橙染色观察PDS诱导细胞凋亡情况；流式细胞仪分析细胞周期并计算细胞平均凋亡率；免疫细胞化学技术观察细胞内半胱氨酸蛋白水解酶（caspase）9的表达。结果经中（100mg/L）、高（200mg/L）剂量的PDS处理后，U251细胞生长受到不同程度抑制，且呈现剂量依赖性；吖啶橙荧光染色可见经中、高剂量PDS处理后的细胞呈现凋亡形态，并

2、随药物剂量增加凋亡细胞数增多；流式细胞术结果显示，PDS可明显提高细胞的凋亡率，呈剂量依赖关系；免疫细胞化学染色结果表明，随着PDS剂量增加，细胞内激活的caspase9的表达上调。结论PDS体外对U251细胞增殖具有明显的抑制作用，其机制可能与诱导细胞凋亡有关。【关键词】细胞凋亡；人参二醇皂苷；细胞周期人参为五加科多年生草本植物，其成分具有抗肿瘤、抗衰老、抗辐射等多种生物活性作用〔1〕。人参皂苷是人参中主要的有效成分，迄今已确定结构的至少在30种以上，人参二醇组皂苷（PDS）即是其中一种，具有抗缺血再灌注损伤、清除氧自由基、抗氧化、阻滞钙通道等

3、多种生物学效应〔2，3〕。本研究通过观察PDS体外对U251细胞增殖及凋亡的影响，探讨其抗肿瘤机制。1材料与方法1.1试剂PDS由吉林大学药学院天然药物分析实验室提取；四甲基偶氮唑蓝(MTT)为美国Sigma公司产品；激活的半胱氨酸蛋白水解酶（caspase）9多克隆抗体购于Takara公司，顺铂为山东齐鲁制药厂生产。1.2细胞系及培养条件人胶质瘤细胞株U251(中科院上海细胞生物化学研究所提供)培养在含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，置37℃、5%CO2湿化的培养箱中，待细胞长满80%培养瓶时，分组加药。1.3实验方法1.3.1实验分

4、组RPMI1640空白对照组（A组）；2μmol/L顺铂组(阳性对照组，B组)；PDS低剂量（50mg/L）组（C组）、中剂量（100mg/L）组（D组）、高剂量（200mg/L）组（E组）。1.3.2细胞形态观察取对数生长期细胞,调整细胞密度为1×105接种于24孔板,1ml/孔。培养过夜后换新鲜的培养液,按前述分组加药，48h后倒置显微镜下观察细胞形态。1.3.3MTT比色法在96孔培养板，接种细胞1×105/孔，每组4孔，加药孵育20h及44h后每孔加MTT(5g/L)20μl，继续孵育4h吸弃培养液，每孔加入DMSO100μl，震荡10m

5、in，用酶标仪(波长570nm)测定各孔吸光度值(A)，计算细胞生长抑制率，抑制率≥30%为细胞对该药敏感。抑制率=(对照组A值-给药组A值)/对照组A值×100%。1.3.4吖啶橙染色将10mg吖啶橙溶于100ml、pH值为6.8的PBS中，过滤后4℃避光保存。细胞爬片经不同药物处理后，加入20μl吖啶橙储存液，荧光显微镜下观察，拍照。1.3.5流式细胞仪检测传代培养的U251细胞接种于培养瓶中（1×106/瓶），次日加药处理，48h后收集细胞，冷PBS洗2次，-20℃、70%的冷乙醇固定，加入115mlPI(50mg/L)染色。混匀后上流式细

6、胞仪做单参数分析，用累积曲线分割法计算各期细胞比例。1.3.6免疫细胞化学染色将大小适合的盖玻片放入6孔培养板中，接种细胞为5×105/孔，37℃、5%CO2中培养，次日加药，继续培养48h，PBS清洗，4%多聚甲醛固定，免疫细胞化学技术观察细胞内激活的caspase9表达情况。1.4统计学处理数据处理采用SPSS9.0统计软件，数据以x±s表示,组间比较采用χ2检验。2.1.2不同药物对U251细胞增殖抑制作用随着PDS浓度增加和作用时间的延长,细胞增殖抑制率逐渐增高,且呈明显时间、剂量依赖性。见表1。表1不同时间PDS对U251细胞的增殖抑制

7、率（略）2.2细胞凋亡检测2.2.1吖啶橙染色A组细胞呈均匀绿色，形态规则，未见凋亡细胞；D、E组细胞出现不规则橘黄色荧光，细胞体积变小，胞核皱缩，呈现凋亡细胞的形态改变，且个别细胞胞膜破裂。见图2。2.2.2流式细胞术结果与A组相比,给药48h后，D、E组在G1期前出现明显凋亡峰，呈现剂量依赖关系。见表2。表2给药48hPDS对U251细胞周期及凋亡率的影响（略）2.2.3细胞免疫化学结果A组细胞caspase9表达弱阳性，经PDS处理的细胞casapae9表达明显上调，胞质中出现大量的棕黄色颗粒，随时间延长，剂量增加阳性细胞数增多，染色增强。

8、见图3。3讨论胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤，约占颅内肿瘤的46％，占成年人全身肿瘤的2％；恶性胶质瘤的发病率为(5～8)／100万，在1