抗11β羟类固醇脱氢酶1的单克隆抗体的制备与鉴定

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1、抗11β羟类固醇脱氢酶1的单克隆抗体的制备与鉴定：王婉,杨金菊,刘莉,陈志成,高媛,高建恩,安立国,孙启鸿【摘要】　　目的:制备抗人11β羟类固醇脱氢酶1（homosapienshydroxysteroid11betadehydrogenase1,HSD11B1）的单克隆抗体（mAb）并初步鉴定其特性。方法:将正常成人肝组织匀浆离心并分离线粒体,用线粒体总蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备mAb,并通过间接ELISA法、r)为35000的蛋白;应用mAbCBF245对人肝脏cDNA表达文库（UniZAPXR）进行筛选,阳性噬菌斑测序结果显示5个阳性克隆插

2、入序列均为HSD11B1。结论:mAbBAD062特异地识别抗原HSD11B1,该mAb可用于ELISA检测、:Togenerateandidentifymonoclonalantibodies(mAb)againsthomosapienshydroxysteroid11betadehydrogenase1(HSD11B1).METHODS:Normalhumanlivertissuesogenized,andmitochondriaitochondrialproteinsmunizeBALB/cmicetogeneratemAbbyhybridomatechnique

3、.ThemAbmunohistochemistry.Theantibodyspecificitymunoprecipitation(IP),andconfirmedbyUniZAPexpressionlibraryscreening.RESULTS:OnehybridomaCBF245secretingspecificmAbagainstHSD11B1Abmunohistochemistry.OurdatashoAb,olecularitochondriaofhumanlivertissue.TheCBF245mAbedbyimmunoscreeningofUniZA

4、PXRlivercDNAexpressionlibrary.CONCLUSION:AhybridomacelllinestablysecretingspecificmAbagainstHSD11B1isestablishedandcharacterized.ThismAbreactedmunohistochemistryassay,IP,andAb;mitochondria　　11β羟类固醇脱氢酶1（homosapienshydroxysteroid11betadehydrogenase1,HSD11B1）属于短链脱氢/还原酶蛋白超家族(SDR),为相对分子质量(Mr

5、)为34000的糖蛋白。此酶主要以糖基化的形式存在于微粒体,其作用依赖于辅酶NADP,在体内负责活性的糖皮质激素向其无活性前体的转换,调节局部糖皮质激素浓度,并决定糖皮质激素流向其受体[1]。代谢综合征糖皮质激素敏感性增加,HSD11B1调节异常,可能是肥胖、糖耐量低减、高血压和心血管疾病等代谢综合征重要发病机制之一,选择性HSD11B1抑制剂有望成为其治疗靶点。HSD11B1在体内广泛表达,多分布于肝、肺、脂肪组织、脉管系统、卵巢及中枢神经系统。我们在成人肝脏线粒体单克隆抗体(mAb)库的建立中,应用线粒体总蛋白免疫BALB/c小鼠制备mAb,其中1株为鼠抗人HSD11

6、B1mAb,并对其特异性进行了鉴定,为进一步研究HSD11B1的作用奠定了基础。　　1材料和方法　　1.1材料免疫和筛选用成人肝组织线粒体总蛋白,由本室制备;弗氏佐剂为Sigma公司产品;羊抗鼠IgGHRP为中山公司产品;蛋白酶抑制剂为Roche公司产品;BCA蛋白定量试剂盒为Pierce公司产品;cDNA表达文库为美国Stratagene公司产品;PVDF膜、ECL反应试剂盒均为Amersham公司产品;DY89Ⅱ型电动玻璃匀浆机构自宁波新芝生物科技股份有限公司。　　1.2方法　　1.2.1成人肝组织线粒体总蛋白抗原的制备成人肝组织匀浆700～750r/min,10

7、g组织加40mL匀浆缓冲液800g离心10min,取上清,10000g离心10min,沉淀即为线粒体,用匀浆缓冲液洗2次[2]。用RIPA裂解液裂解线粒体样品,离心后取上清,获得线粒体总蛋白。采用BCA法测定蛋白浓度,计算线粒体的得率,通过测定匀浆液和分离的线粒体中的琥珀酸脱氢酶的活性计算线粒体的富集度,SDSPAGE鉴定抗原的Mr。　　1.2.2鼠抗人mAb的制备首次免疫免将线粒体总蛋白1mg与等体积弗氏完全佐剂混合后进行充分乳化,多点皮下注射。首次免疫后4周加强免疫1次,1周后经尾静脉取血,分离血清,ELISA法包被线粒