活血潜阳方对自发性高血压大鼠心肌肥厚组织原癌基因cfos和cmyc表达的影响

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1、活血潜阳方对自发性高血压大鼠心肌肥厚组织原癌基因cfos和cmyc表达的影响：符德玉,王世红,周端,马宇滢,金露,祖亮华【摘要】目的：通过分析左心室心肌原癌基因cfos和cmycmRNA及蛋白的表达，探讨活血潜阳方改善自发性高血压大鼠（spontaneoushypertensiverat,SHR）左心室肥厚的作用机制。方法：以10周龄的SHR为高血压左心室肥厚模型，随机分为SHR模型组，中药大、中、小剂量治疗组，西拉普利治疗组，年龄和性别相匹配的京都（ethods:TheexperimentalstudyatchedPUSBH2型显微镜，日本奥林巴斯公司生产，稳定电压为

2、4.03V；透射电镜，日立H600型；Panasonic摄像机，分辨率480线，日本松下公司生产；IMS细胞图像分析系统，免疫组化定量分析软件，上海申腾信息技术有限公司生产。　　1.2实验方法　　1.2.1分组及用药　　SHR随机各分为5组，每组5只（4雄、1雌）。具体分为SHR模型组，中药大（生药浓度0.84g/ml，相当于成人剂量的24倍）、中（生药浓度0.42g/ml，相当于成人剂量的12倍）和小（生药浓度0.21g/ml，相当于成人剂量的6倍）剂量治疗组，西拉普利组。l/(kg·d)不同药液灌胃，模型组和g/kg）腹腔注射麻醉动物，即刻取出心脏，进行主动脉逆行灌洗（4

3、℃生理盐水），即刻（5min内）以无酶水配制的4%多聚甲醛固定液固定，固定液容量为组织块体积的10倍。每组有3只（2雄、1雌）大鼠的心脏进行cfos、cmyc免疫组化及原位杂交实验（余进行胶原Ⅰ、Ⅲ的基因和蛋白表达实验，文章待发表）；每只大鼠每个指标取3张切片（共得9个数据）。操作时需无菌，取材器械事先进行高压灭菌，尽量做到无RNA酶，固定标本后尽早进行石蜡包埋。　　1.2.3免疫组化法检测心肌组织cfos和cmyc蛋白表达　　左室游离壁，常规固定，石蜡包埋，切片，石蜡切片以二甲苯脱蜡及梯度酒精（无水酒精至50%）脱水。pH6.0柠檬酸缓冲液入微波炉煮沸8min，PBS

4、缓冲液冲洗3次×3min，0.3%过氧化氢甲醇液阻断内源性过氧化物酶，室温下20min，PBS冲洗3次×3min，正常动物血清保护，室温下20min，滴加cfos和cmyc抗体，平放于湿盒内，37℃孵育1.5h，PBS冲洗3次×3min，滴加EnVision，放入湿盒内，室温下30min，PBS冲洗3次×3min，二氨基联苯胺（diaminobenzidine,DAB）显迹，苏木素染核1min，1%盐酸酒精分化，流水冲洗蓝化，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。显微镜下观察心肌细胞，核棕黄色者为阳性细胞。　　1.2.4原位杂交法检测心肌组织cfos和cmycmRNA

5、表达　　左心室游离壁，无RNA酶的条件下固定、浸蜡包埋。石蜡切片二甲苯脱蜡及梯度酒精脱水，PBS洗2次×3min；切片入0.01mol/LTritonX100内10min，PBS洗2次×3min；经1%H2O2处理抑制内源性过氧化物酶，蛋白消化，终止消化后，切片放入0.01mol/LpH6.0柠檬酸缓冲液中，微波炉Ⅲ档（98℃）加热10min，冷却，PBS洗3次×3min，预杂交2h，42℃，不洗，在杂交液中加入多相寡核苷酸探针4μg/ml，20μl/片，杂交12～18h，上覆盖蜡膜防蒸发，湿盒内加入少量甲酰胺缓冲。杂交后42℃柠檬酸缓冲液系列洗脱，再进行生物素化抗地高辛抗体

6、信号放大检测，0.04%DAB+0.03%H2O2，显色8～12min，苏木素衬染30s，水洗，盐酸乙醇分化，水洗片刻，微波蓝化，常规树脂封片。观察心肌细胞核棕褐色者为阳性细胞。对照设计：阴性对照用不加探针的杂交液杂交，用PBS代替生物素化抗地高辛抗体，显示结果为阴性结果。阳性对照设计，以已知肺癌阳性切片做阳性对照。　　1.2.5图像分析　　选择200倍视野，每张切片随机观察5个视野，按照一定的域值分割阳性细胞，利用分析软件计算每个视野中阳性表达的光密度值，然后计算平均值。再测定cfos和cmyc表达的平均积分吸光度的阳性面积，并计算表达指数。表达指数=（阳性面积值×光密度

7、）/100。　　1.3统计学方法　　各组数据以x±s表示，采用SPSS10.0版软件进行统计分析，组间比较用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。　　2.2活血潜阳方对SHR左心室心肌组织cmycmRNA及蛋白表达的影响　　免疫组化检测提示24周龄SHR左室心肌组织cmycmRNA及蛋白表达高于同龄的olecularcardiology:aneedicine.Tianjin:TianjinScienceandTechnologyPress.2001:146147,158