广州市登革1型病毒基因组测序及系统进化分析

《广州市登革1型病毒基因组测序及系统进化分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、广州市登革1型病毒基因组测序及系统进化分析：文金生，江丽芳，晏辉钧【摘要】目的：对引起2002年广州登革热的登革1型病毒分离株（71/02GZ）进行全基因组测序和系统进化分析。方法：采用C6/36细胞培养71/02GZ，分别采用RT-PCR，5’RACE和3’RACE扩增基因组中编码区序列、5’和3’末端非编码区序列，PCR产物克隆到载体并测序，拼接成全基因组序列，分别基于E基因序列、E/NS1连接区240nt、基因组中10016nt进行系统进化分析。结果：71/02GZ株基因组全长10735nt，两端非编码区（NCR）长度分别为94nt和462nt。基于E基因序列、E/NS1连

2、接区240nt、基因组中10016nt的进化分析结果显示71/02GZ株和2002年广州分离株（GZ01/02，GZ/218/2002），1995年广东分离株（GD23/95，GD01/95）、1995年广州分离株（GZ01/95）组成一个基因型；而1999年广东分离株（GD05/99），1997年广东分离株（GD14/97）和1980年广州分离株（GZ/80）属于另一个基因型；另外，71/02GZ株同1998年印度尼西亚分离株（98901530DFDV-1-ID）的同源性最高。结论：71/02GZ株可能是印度尼西亚输入的。【关键词】登革病毒；测序；系统进化分析　　Abstrac

3、t:Objective:ToperformpletegenomesequencingandphylogeicanalysisofaDENV-1isolated(71/02GZ)strainentsinviralgenomeincluding5’terminaland3’terminalplifiedusingRT-PCR，5’RACEand3’RACE；PCRproducte，thephylogeicrelationshipof71/02GZisolatesandotherDENV-1isolateseof71/02GZinaland3’terminalNCRse，shoembe

4、rsofanothergenotype.Inaddition，71/02GZstrainaybeimportedfromIndonesia.　　Keyorrhagicfever，DHF）/登革休克综合征（Dengueshocksyndrome，DSS）。2002年DENV-1在广州市区引起1423例患者发病[2-4]。与以往相比，此次大流行具有典型的特点：①流行持续时间长，各年龄组都有发病患者；②疫情来势凶猛，爆发点多，涉及面广；③本次流行是历史上在广州市区内发生的规模最大的一次。因此，阐明此次流行登革病毒株的可能对于登革的预防、控制以及疫苗的研发具有重要的指导意义。本研究拟采用

5、RT-PCR，5’RACE和3’RACE等技术对本次流行时分离的一株DENV-1（71/02GZ）进行全序列测定，并基于全基因组序列、E基因序列和E/NS1连接区240nt，使用Mega4.0软件进行系统进化分析。　　1材料和方法　　1.1病毒株　　71/02GZ株于2002年自广州1例DF患者血清中分离（采用C6/36细胞），型特异性RT-PCR检测证实其为DENV-1。71/02GZ株冻存于液氮中。　　1.2引物设计与合成　　参考DENV-1的SingaporeS275/90株(GenBankAccessionNumber：M87512)和1998年印度尼西亚分离株(GenB

6、ankAccessionNumber：AB189121)，利用Primerpremier5设计扩增编码区的13对引物，5’非编码区（NCR）下游引物，3’NCR上游引物，引物由Invitrogen公司合成，引物见表1。　　1.3病毒RNA的提取及逆转录　　将71/02GZ接种到长成单层的C6/36细胞，2～3d后，当细胞病变（CPE）出现（+++）时，收集细胞及培养液用于提取RNA。0.2mL病毒液加入1mLTrizol，混匀，室温10min。加入氯仿0.2mL，振动15s，室温10min。4℃12000次/min，离心15min。吸取上清，加入异丙醇0.5mL，室温10min。

7、4℃12000g/min，离心15min。去上清，加入冷冻的75%乙醇1mL洗涤1次。4℃7500g/min，离心10min。去上悬液，空气干燥。用DEPC处理水溶解RNA沉淀。总RNA5μL＋DEPC处理水34μL＋下游引物（25μmol/L）2μL。65℃55min。加入10×Buffer5μL，10mmol/LdNTP2μL，RNA酶抑制剂1μL，逆转录酶1μL。42℃1h，90℃5min。　　1.4编码区的扩增、克隆和测序　　50μL（EXTaq酶0.25μL，10×Bu