冻干小鼠神经生长因子的研制

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1、冻干小鼠神经生长因子的研制　　摘要:目的研制小鼠神经生长因子（NGF）.方法采用二次阳离子柱层析法，从雄性小鼠颌下腺分离提取2.5S神经生长因子，建立了稳定的实验室与中试生产工艺，以及相应的质量鉴定规程.结果从体质量超过25g，鼠龄大于60d的雄性小鼠体内可获得高纯度、高产量、高活性的2.5SNGF.纯度大于95%，与抗2.5SNGF抗体有特异结合能力，鸡胚背根神经节培养法测定的生物活性显示，其比活性达到5×108BU・g-1（BU:生物活性单位）以上，各项指标均符合质量鉴定标准.20g・L-

2、1人血白蛋白做冻干赋形剂，能有效保护NGF的生物活性.结论研制了高质量的冻干小鼠神经生长因子，为NGF的临床前和临床研究奠定了基础.　　Keyouse;extraction;qualityassurance　　Abstract:AIMToinvestgateandputNGFonclinic.METHODSobley等［8］的二次阳离子柱层析法从小鼠颌下腺中制取2.5SNGF.首先用CMI层析柱在pH近中性条件下吸附颌下腺匀浆上清中等电点大于6.8的杂蛋白并予以分离去除，收集穿过峰;然后在pH小于5的条件下使NGF解离为

3、αNGF，βNGF以及γNGF亚基，利用βNGF与其他亚基等电点的差异，使用CMII层析柱吸附有生物活性的βNGF及其衍生物（共称为2.5SNGF组分），分段洗脱，收集2.5SNGF组分.　　1.2.2紫外吸收光谱及蛋白含量测定用PEλ14型可见/紫外分光光度计对样品进行扫描，波长范围为200～320nm;Lom，含pH3.5～10两性电解质，上样样品量20～30μL，电泳条件为:电压1500V，功率1EM培养液，在无血清条件下37℃培养24～48h，倒置显微镜下进行相差观察，确定NGF提取物的生物活性，以突起生长最好的

4、稀释度的倒数定为NGF生物活性单位（BU）.　　1.2.6冻干用生理盐水配制的60g・L-1甘露醇或20g・L-1白蛋白将检定合格的半成品稀释至5×106BU・L-1，0.22μm滤膜过滤除菌.使用2mL西林瓶，每支分装0.5mL，内含2.5SNGF2500BU，冻干得成品，置4℃以下干燥处保存.　　2结果　　2.1鼠龄与体质量对最终产量的影响鼠龄低于60d，体质量少于20g的未成年小鼠，不仅最终NGF的产量明显低于成年雄性小鼠，而且其生物活性也明显低于标准，相反，使用体质量超过

5、30g的种公鼠颌下腺，2.5SNGF的终产量更高（Tab1），制备量扩大至每次2000只成年雄鼠，获得了相似的结果.　　2.2紫外吸收光谱及蛋白质含量2.5SNGF提取物呈典型的蛋白吸收曲线，最大吸收峰值为（280±1）nm;半成品蛋白含量大于0.15g・L-1.　　2.3纯度及分子质量在SDS-PAGE电泳中，纯化产物形成一条稍宽的带（Fig1），凝胶扫描纯度大于95%，Mr为13500.　　表1小鼠鼠龄和体质量对NGF产量与活性的影响　略　　图1略　　2.4鉴别试验与等电点将2.5SNGFSDS-PAG

6、E带转移到NC膜上，与NGF抗体进行结合反应，经免疫显色，NC膜上相应于2.5SNGF带处出现1条棕色带（Fig2）;等电聚焦电泳出现3条带，其pI值分别为8.7，9.0和9.2（Fig3）.　　图3略　　2.6赋形剂和保护剂的选择采用60g・L-1甘露醇做赋形剂和保护剂，冻干后成形、色泽均良好，但其生物活性损失很大;使用20g・L-1白蛋白，冻干后活性无损失，各种理化指标均符合标准，但成形稍差，结构略显疏松.　　3讨论　　NGF主要于唾液腺如颌下腺、前列腺、蛇毒及脑内胆碱能神经元支配区，其中

7、以成年雄性小鼠颌下腺含量最高.小鼠颌下腺NGF是7SNGF的高分子物，含有α，β，γ3个亚单位，具有生物活性的是同源β二聚体，每个单体含118个氨基酸，Mr约13500，等电点约9.2.研究结果［10，11］显示人鼠间NGF基因编码的β亚单位氨基酸序列同源性高达89%，且哺乳动物NGF受体具有高度的保守性，表明不同物种间的NGF具有相同的生物学功能.因此我们选择成年雄性小鼠为研究对象，建立了从其颌下腺分离纯化βNGF的制备工艺及相应的质量检定标准.　　βNGF肽链常发生两种修饰，一种发生在N端，水解失去含8个氨基酸残基的

8、肽段，另一种发生在C端，水解失去一个精氨酸残基.这就衍生出NGF的多种形式，它们彼此之间存在着等电点、分子质量的微小差异.因沉降系数约为2.5，故被统称为2.5SNGF.因为上述修饰不涉及活性中心部位重要的氨基酸残基，所以各种形式仍具有βNGF的全部活性［12，13］.我们纯化的2.5SNGF在等电聚焦电泳中出现3条