冻干小鼠神经生长因子的研制论文

《冻干小鼠神经生长因子的研制论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、冻干小鼠神经生长因子的研制论文.freelouse;extraction;qualityassuranceAbstract:AIMToinvestgateandputNGFonclinic.METHODSobley等［8］的二次阳离子柱层析法从小鼠颌下腺中制取2.5SNGF.首先用CMI层析柱在pH近中性条件下吸附颌下腺匀浆上清中等电点大于6.8的杂蛋白并予以分离去除，收集穿过峰;然后在pH小于5的条件下使NGF解离为αNGF，βNGF以及γNGF亚基，利用βNGF与其他亚基等电点的差异，使用CMII层析柱

2、吸附有生物活性的βNGF及其衍生物（共称为2.5SNGF组分），分段洗脱，收集2.5SNGF组分.1.2.2紫外吸收光谱及蛋白含量测定用PEλ14型可见/紫外分光光度计对样品进行扫描，波长范围为200～320nm;Lom，含pH3.5～10两性电解质，上样样品量20～30μL，电泳条件为:电压1500V，功率1EM培养液，在无血清条件下37℃培养24～48h，倒置显微镜下进行相差观察，确定NGF提取物的生物活性，以突起生长最好的稀释度的倒数定为NGF生物活性单位（BU）.1.2.6冻干用生理盐水配制的60g

3、L-1甘露醇或20gL-1白蛋白将检定合格的半成品稀释至5×106BUL-1，0.22μm滤膜过滤除菌.使用2mL西林瓶，每支分装0.5mL，内含2.5SNGF2500BU，冻干得成品，置4℃以下干燥处保存.2结果2.1鼠龄与体质量对最终产量的影响鼠龄低于60d，体质量少于20g的未成年小鼠，不仅最终NGF的产量明显低于成年雄性小鼠，而且其生物活性也明显低于标准，相反，使用体质量超过30g的种公鼠颌下腺，2.5SNGF的终产量更高（Tab1），制备量扩大至每次2000只成年雄鼠，获得了相似的结果.2.2紫外

4、吸收光谱及蛋白质含量2.5SNGF提取物呈典型的蛋白吸收曲线，最大吸收峰值为（280±1）nm;半成品蛋白含量大于0.15gL-1.2.3纯度及分子质量在SDS-PAGE电泳中，纯化产物形成一条稍宽的带（Fig1），凝胶扫描纯度大于95%，Mr为13500.表1小鼠鼠龄和体质量对NGF产量与活性的影响略图1略2.4鉴别试验与等电点将2.5SNGFSDS-PAGE带转移到NC膜上，与NGF抗体进行结合反应，经免疫显色，NC膜上相应于2.5SNGF带处出现1条棕色带（Fig2）;等电聚焦电泳出现3条带，其pI值

5、分别为8.7，9.0和9.2（Fig3）.图2略2.5生物活性及比活性采用中国药品生物制品检定所提供的2.5SNGF参比品为标准，经校正，我们实验中提取的各批样品生物活性一般大于5×107BUL-1.根据计算，比活性不低于5×108BUg-1蛋白.图3略2.6赋形剂和保护剂的选择采用60gL-1甘露醇做赋形剂和保护剂，冻干后成形、色泽均良好，但其生物活性损失很大;使用20gL-1白蛋白，冻干后活性无损失，各种理化指标均符合标准，但成形稍差，结构略显疏松.3讨论NGF主要来源于唾液腺如颌下腺、前列腺、蛇毒及脑

6、内胆碱能神经元支配区，其中以成年雄性小鼠颌下腺含量最高.小鼠颌下腺NGF是7SNGF的高分子物，含有α，β，γ3个亚单位，具有生物活性的是同源β二聚体，每个单体含118个氨基酸，Mr约13500，等电点约9.2.研究结果［10，11］显示人鼠间NGF基因编码的β亚单位氨基酸序列同源性高达89%，且哺乳动物NGF受体具有高度的保守性，表明不同物种间的NGF具有相同的生物学功能.因此我们选择成年雄性小鼠为研究对象，建立了从其颌下腺分离纯化βNGF的制备工艺及相应的质量检定标准.βNGF肽链常发生两种修饰，一种发

7、生在N端，水解失去含8个氨基酸残基的肽段，另一种发生在C端，水解失去一个精氨酸残基.这就衍生出NGF的多种形式，它们彼此之间存在着等电点、分子质量的微小差异.因沉降系数约为2.5，故被统称为2.5SNGF.因为上述修饰不涉及活性中心部位重要的氨基酸残基，所以各种形式仍具有βNGF的全部活性［12，13］.我们纯化的2.5SNGF在等电聚焦电泳中出现3条带，即为βNGF的不同修饰形式，其结果与文献［2］报道一致.在研制过程中，我们发现鼠龄和体质量对NGF的产量有较大的影响，鼠龄越大，NGF产量越高，生物活性也

8、随之升高.这是由于NGF的产生是由雄激素刺激NGF在颌下腺粒曲导管细胞表达的结果，所以动物来源应是60d龄以上的成年雄性小鼠，未成熟鼠和雌鼠不宜选用.另外，我们观察了两种不同的赋形剂对冻干样品外观及生物活性的影响，NGF做为一种多肽类生物活性物质，在体外极易失活，20gL-1白蛋白对NGF活性的保护优于60gL-1甘露醇.致谢本工作得到生物化学与分子生物学教研室王国华高级实验师、药立波教授等的大力支持与帮助.