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时间:2018-05-05
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1、TNP┐470对结肠癌Lovo细胞生长的抑制作用【关键词】结肠肿瘤关键词:TNP-470;Lovo细胞;脱噬作用;结肠肿瘤摘要:目的探讨TNP-470对体内外人结肠癌Lovo细胞生长的影响.方法采用MTT法检测TNP-470对体外培养的Lovo细胞的生长抑制作用.建立结肠癌皮下移植瘤模型,16只裸鼠平均分为治疗组(TNP-47030mgkg-1)和对照组(相同体积的生理盐水),4m3,对照组为(1345±38)mm3,(P<0.01).治疗组Lovo细胞凋亡率为(21.4±2.1)%,对照组为(7.5±1.
2、5)%,(P<0.001).结论TNP-470能够抑制结肠癌Lovo细胞的体内外生长,其机制可能与诱导细胞凋亡有关. Keys Abstract:AIMTostudytheeffectofTNP-470onthegroancoloncancercellline,Lovocells,invitro andinvivo.METHODSGroinedbyanMTTassay.Humancoloncancerxenograftsice.TNP-470(30mg/kg)orthesamevolumeofsalin
3、esolutioninisteredonalternativedaystarting1daysaftertu-morimplantation.Miceorsination.Inboththetreatmentandcontrolgroups,tumorvolumeseasuredusingHEstainingandTdT-mediatedbiotinyated-dUTPnickendlabeling(TUNEL)method.RESULTSInvitro,TNP-470inhibitedthegroorvolum
4、es[(1345±38)mm3vs(731±40)mm3,P<0.01)]orgroaybeassociated下测吸光度(A)值.按下列公式计算细胞生长抑制率:生长抑制率(%)=(对照组平均A-实验组平均A)/(细胞对照组A-空白对照组A)×100%. 1.2.2皮下移植瘤抑制实验收集培养3d的Lovo细胞,生理盐水制成悬液,用1.0mL微量注射器将0.2mL细胞悬液(5×106~5×107)注入2只裸鼠颈部皮下.注射前注射部位消毒,4d后重复接种1次.当接种部位肿瘤长至15~20mm时,无菌条件下取材
5、.将肿瘤组织剪成1.5~2.0mm小块,置于生理盐水中备用.裸鼠以20gL-1氯胺酮0.2~0.3mL麻醉成功后,乙醇消毒接种部位皮肤,将切好的肿瘤组织块置于18号套管针口,分批接种于裸鼠背部皮下.16只裸鼠随机分成2组,两组裸鼠体质量差异无显著性.手术当天给药,TNP-47030mgkg-1,sc,qod,对照组给相同体积的生理盐水.接种30d后断颈处死裸鼠,测量肿瘤体积,计算抑瘤率.将肿瘤组织于40gL-1中性甲醛固定24h,石蜡包埋,连续切片(4μm),常规HE染色及TUNEL标记染色.抑瘤率(%)=(对照
6、组肿瘤体积-实验组肿瘤体积)/对照组肿瘤体积×100%. 1.2.3TUNEL染色检测凋亡细胞TUNEL染色具体步骤如下:切片经二甲苯脱蜡,乙醇梯度脱水至水化,滴加20mgL-1蛋白酶K,室温消化15min,去离子水洗5min×2,30mLL-1过氧化侵氢甲醇液中室温下封闭10min,0.05molL-1PBS洗5min×2,向组织片滴加平衡缓冲液,室温下孵育60min,滤纸吸取标本周围液体,迅速滴加TdT酶,置湿盒中37℃孵育60min,室温下切片入终止缓冲液中振荡孵育10min,0.05molL-1PBS洗
7、2min×3,滴加过氧化物酶,室温下湿盒中孵育30min,0.05molL-1PBS洗2min×4,DAB显色5~10min,甲基绿复染10min,脱水、透明、封片.以0.05molL-1PBS替代TdT酶作为阴性对照. 结果判定:以细胞核阳性为标准,凋亡细胞呈棕黄色细颗粒状或弥散性,散在或簇状分布于肿瘤组织中,个别者核膜增厚,呈棕黄色染色.结合HE染色,选择无细胞坏死的5个视野或HE染色证实为坏死的细胞不计数,采用德国KontronIBAS2.5型全自动图像分析系统对TUNEL染色阳性细胞进行计数,每个视野计
8、数1000个以上细胞,以阳性细胞所占百分率作为凋亡指数(apoptosisindex,AI),取5个视野AI均值进行统计学分析. 统计学处理:所有数据采用均数±标准差(x±s)表示,均数间比较用t检验,采用Spss10.0统计软件分析. 图1略 2.2肿瘤体积两组裸鼠皮下移植瘤在移植12d后生长明显,但TNP-470组肿瘤在20d后生长几乎处于停滞状态,体积未见明显
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