tnp┐470对结肠癌lovo细胞生长的抑制作用

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1、TNP┐470对结肠癌Lovo细胞生长的抑制作用【关键词】结肠肿瘤关键词:TNP-470;Lovo细胞;脱噬作用;结肠肿瘤摘要:目的探讨TNP-470对体内外人结肠癌Lovo细胞生长的影响.方法采用MTT法检测TNP-470对体外培养的Lovo细胞的生长抑制作用.建立结肠癌皮下移植瘤模型，16只裸鼠平均分为治疗组（TNP-47030mgkg-1）和对照组（相同体积的生理盐水），4m3，对照组为（1345±38）mm3，（P<0.01）.治疗组Lovo细胞凋亡率为（21.4±2.1）%，对照组为（7.5±1.

2、5）%，（P<0.001）.结论TNP-470能够抑制结肠癌Lovo细胞的体内外生长，其机制可能与诱导细胞凋亡有关.　　Keys　　Abstract:AIMTostudytheeffectofTNP-470onthegroancoloncancercellline，Lovocells，invitro　andinvivo.METHODSGroinedbyanMTTassay.Humancoloncancerxenograftsice.TNP-470（30mg/kg）orthesamevolumeofsalin

3、esolutioninisteredonalternativedaystarting1daysaftertu-morimplantation.Miceorsination.Inboththetreatmentandcontrolgroups，tumorvolumeseasuredusingHEstainingandTdT-mediatedbiotinyated-dUTPnickendlabeling（TUNEL）method.RESULTSInvitro，TNP-470inhibitedthegroorvolum

4、es［（1345±38）mm3vs（731±40）mm3，P<0.01）］orgroaybeassociated下测吸光度（A）值.按下列公式计算细胞生长抑制率:生长抑制率（%）=（对照组平均A-实验组平均A）/（细胞对照组A-空白对照组A）×100%.　　1.2.2皮下移植瘤抑制实验收集培养3d的Lovo细胞，生理盐水制成悬液，用1.0mL微量注射器将0.2mL细胞悬液（5×106～5×107）注入2只裸鼠颈部皮下.注射前注射部位消毒，4d后重复接种1次.当接种部位肿瘤长至15～20mm时，无菌条件下取材

5、.将肿瘤组织剪成1.5～2.0mm小块，置于生理盐水中备用.裸鼠以20gL-1氯胺酮0.2～0.3mL麻醉成功后，乙醇消毒接种部位皮肤，将切好的肿瘤组织块置于18号套管针口，分批接种于裸鼠背部皮下.16只裸鼠随机分成2组，两组裸鼠体质量差异无显著性.手术当天给药，TNP-47030mgkg-1，sc，qod，对照组给相同体积的生理盐水.接种30d后断颈处死裸鼠，测量肿瘤体积，计算抑瘤率.将肿瘤组织于40gL-1中性甲醛固定24h，石蜡包埋，连续切片（4μm），常规HE染色及TUNEL标记染色.抑瘤率（%）=（对照

6、组肿瘤体积-实验组肿瘤体积）/对照组肿瘤体积×100%.　　1.2.3TUNEL染色检测凋亡细胞TUNEL染色具体步骤如下:切片经二甲苯脱蜡，乙醇梯度脱水至水化，滴加20mgL-1蛋白酶K，室温消化15min，去离子水洗5min×2，30mLL-1过氧化侵氢甲醇液中室温下封闭10min，0.05molL-1PBS洗5min×2，向组织片滴加平衡缓冲液，室温下孵育60min，滤纸吸取标本周围液体，迅速滴加TdT酶，置湿盒中37℃孵育60min，室温下切片入终止缓冲液中振荡孵育10min，0.05molL-1PBS洗

7、2min×3，滴加过氧化物酶，室温下湿盒中孵育30min，0.05molL-1PBS洗2min×4，DAB显色5～10min，甲基绿复染10min，脱水、透明、封片.以0.05molL-1PBS替代TdT酶作为阴性对照.　　结果判定:以细胞核阳性为标准，凋亡细胞呈棕黄色细颗粒状或弥散性，散在或簇状分布于肿瘤组织中，个别者核膜增厚，呈棕黄色染色.结合HE染色，选择无细胞坏死的5个视野或HE染色证实为坏死的细胞不计数，采用德国KontronIBAS2.5型全自动图像分析系统对TUNEL染色阳性细胞进行计数，每个视野计

8、数1000个以上细胞，以阳性细胞所占百分率作为凋亡指数（apoptosisindex，AI），取5个视野AI均值进行统计学分析.　　统计学处理:所有数据采用均数±标准差（x±s）表示，均数间比较用t检验，采用Spss10.0统计软件分析.　　图1略　　2.2肿瘤体积两组裸鼠皮下移植瘤在移植12d后生长明显，但TNP-470组肿瘤在20d后生长几乎处于停滞状态，体积未见明显