寨卡提取物体外对人结肠癌细胞凋亡的诱导作用及其作用机制研究

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1、寨卡提取物体外对人结肠癌细胞凋亡的诱导作用及其作用机制研究作者：江南，曾瑾，清源，罗霞，杨志荣【摘要】　　目的研究寨卡提取物诱导人结肠癌LoVo细胞凋亡的作用，并对其可能的作用机制进行探讨。方法以寨卡提取物作用于人结肠癌LoVo细胞，采用MTT法分析寨卡提取物对LoVo肿瘤细胞的抑制生长作用；采用AnnexinV-FITC荧光染色实验，考察细胞在药物作用下的质膜变化，对提取物诱导LoVo细胞凋亡进行检测；采用比色法测定寨卡提取物对人大肠癌LoVo肿瘤细胞内还原型谷胱甘肽（GSH）的耗竭作用和对谷胱甘肽-S转移酶（GST）的诱导作用；同时利用DCF

2、H-DA探针，检测LoVo肿瘤细胞给药后的活性氧水平；应用ethodsMTTassayployedtoevaluatethesurvivalofLoVocells.Theinductionofapoptosisanner,andIC50l-1.ZAFcouldobviouslydepletthelevelofGSHlevel,increaseactivityofGST,andaccumulateROSinLoVocells.Over-expressionofCaspase-3andCaspase-9mediatedbyZAFinaconcentr

3、ation-dependentmannerancolorectalcarcinoma；LoVocells　　寨卡是一味常用藏药，为十字花科植物ThlaspiarvenseLinn.的干燥成熟种子。在传统藏医药应用中，寨卡性辛、微温，具有散风明目，活络通痹，温补五脏，清肺热、肾热，健胃之功效，主要用于治疗目赤肿痛流泪，肺热，咳嗽，肾热，淋病，消化不良，呕吐等病症。目前针对寨卡化学成分缺乏系统细致的报道，仅通过初步的植物化学研究所知，寨卡含黑芥子苷（Sinigrin），又含脂肪油34％，挥发油0.836％，蔗糖1.8％，卵磷脂1.6％等［1］。本课题

4、组的前期研究工作发现，寨卡中含有活性强烈的抗肿瘤成分，其有效部位为十字花科植物中富含的硫代葡萄糖苷（glucosinolate）类物质［2］，该有效部位提取物ZAF体外抗肿瘤作用与其抑制细胞增值和诱导细胞凋亡有关［3］，本研究对寨卡提取物诱导LoVo肿瘤细胞凋亡的作用靶点和影响途径进行研究，以探讨寨卡提取物诱导细胞凋亡的作用机制，为开辟寨卡新的药用途径奠定理论基础。　　1材料与仪器　　1.1药品与试剂　　寨卡有效部位提取物（activefractionsofpennycress，ZAF），由四川省中医药研究院中药细胞与分子生物学实验室提供。RPM

5、I-1640培养基（GIBCO公司）；小牛血清（HyClone公司）；AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒（购自碧云天生物技术研究所）；谷胱甘肽-S转移酶测定试剂盒、还原型谷胱甘肽（GSH）测定试剂盒（购自南京凯基生物科技发展有限公司）；活性氧检测试剂盒（购自北京普利莱基因技术有限公司）；兔抗肌动蛋白（β-actin）、鼠抗人半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase-3），兔抗人半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase-9）抗体、抗小鼠IgG、及抗兔IgG均为SantaCruz产品；ECL检测底物I和II（Pierce公司）；台盼蓝，MTT，

6、SDS，胰蛋白酶，EDTA·4Na均购自Sigma公司；青霉素，庆大霉素及其它试剂均为国产分析纯；硝酸纤维素膜(博士德)。　　1.2仪器与设备　　倒置显微镜（Nikon，TS10）；二氧化碳细胞培养箱（Heraeus，BB5060UV）；酶标仪（ThemoElectron，Multiskan）；垂直电泳槽(Bio-radMini-PROTEAN3)；转印槽(Bio-radTrans-blot)；凝胶成相系统（Bio-Rad，ChemiDocXRS）；电泳电源(Bio-radPog·L-1），放置于37℃，5％CO2的培养箱下，取对数生长期细胞进行

7、实验。　　2.2细胞增殖抑制作用的检测　　LoVo细胞（5.0×104个细胞/孔）接种于96孔板，用不同浓度的ZAF作用48h后，采用MTT法［4］，酶标仪于570nm波长处测定各孔吸光度（A570），每个浓度组设3个复孔，细胞抑制率（%）=（对照组A-实验组A）/（对照组A-空白组A）×100%。并计算IC50。实验重复3次。　　2.3AnnexinV-FITC/PI荧光双染色　　取对数生长期LoVo细胞，按5×105个/孔接种于24孔平底细胞培养板，预培养24h。设置3个药物作用浓度，分别为300，550，1000μg·ml-1，每种浓度设3

8、个平行孔，同时做阴性对照孔（加细胞和培养液，不加药物；即药物浓度为0μg·ml-1）。加药后继续培养36h。利用AnnexinV-FIT