欢迎来到天天文库
浏览记录
ID:9647694
大小:51.50 KB
页数:3页
时间:2018-05-04
《genistein对人乳腺癌细胞体外侵袭能力的抑制作用》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在应用文档-天天文库。
1、Genistein对人乳腺癌细胞体外侵袭能力的抑制作用【摘要】目的:研究金雀异黄素(genistein)对人乳腺癌细胞株MDAMB231体外侵袭能力的影响并探讨其机制.方法:采用细胞体外侵袭实验系统,观察genistein对乳腺癌细胞体外侵袭能力的影响;应用MP2,MMP9蛋白表达的变化,采用明胶酶谱分析法对药物作用前后乳腺癌细胞分泌的MMP2,MMP9活性进行分析.结果:在药物作用24,48,72h后,15μmol/L组和30μmol/L组侵袭至Matrilgel滤膜下的细胞数分别为(245±12)个,(300±20)个,(378±18)
2、个和(155±20)个,(204±30)个,(256±34)个,较空白对照组显著减少(P<0.05).MP2蛋白相对值分别为0.71±0.07,0.32±0.06和0.12±0.03;MMP9的相对值分别为0.92±0.06,0.63±0.04和0.24±0.02.明胶酶谱分析结果显示,15,30μmol/L组基质金属蛋白酶活性显著降低(P<0.05).结论:genistein有效抑制乳腺癌侵袭和转移,其作用机制可能与降低乳腺癌细胞运动能力,抑制MMP2,MMP9表达水平与活性有关.【关键词】乳腺肿瘤;染料木黄酮;侵袭;基质金属蛋白
3、酶类0引言金雀异黄素(genistein)是一种植物的异黄酮化合物,是大豆中重要的非营养成份,对人乳腺癌细胞、肝癌细胞等多种肿瘤细胞具有体外抗增殖作用[1],但有关genistein对乳腺癌侵袭转移作用的研究尚少见报道.本研究以人乳腺癌MDAMB231细胞株为研究对象,观察genistein对其侵袭转移的作用并探讨可能的分子机制,为genistein应用于肿瘤临床治疗提供实验依据.1材料和方法1.1材料雌激素受体阴性乳腺癌细胞株MDAMB231(美国模式菌种收集中心ATCC细胞库);genistein,明胶(美国Sigma公司);鼠抗人MMP
4、2,MMP9mAb(北京中山生物工程公司);DMEM培养基(美国Gibco公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);Q550IEM培养液按1∶20稀释后,取100μL包被Transol/L,37℃孵育24,48,72h后,取出Transol/L,pH7.2PBS淋洗,棉签擦拭微孔膜上层,将已经侵入并贴附于微孔膜下层的细胞固定于20g/L多聚甲醛中30min,Giemsa染色后进行细胞计数.1.2.2DAMB231传代于100mm的培养皿中,待细胞贴壁后,分别加入浓度为0,15,30μmol/L的genistein,作用48h后,分别提取
5、细胞总蛋白分析.细胞用冷PBS洗涤2次,用300μLRapa裂解液裂解细胞,细胞裂解物-80℃过夜,然后刮取细胞,以12000g,4℃离心15min,收集上清移入新的1.5mL离心管中,考马斯亮兰法定量样本蛋白浓度.依据测定蛋白浓度,取20μg总蛋白进行100g/LSDSPAGE胶电泳,然后电转移至NC膜上.用含有50g/L去脂奶粉的TBST(TBS+1g/L吐温-20)封闭1.5h;分别加入一抗MMP2,MMP9mAb(各按1∶250稀释),孵育2h,TBST漂洗30min;HRP标记羊抗鼠IgG孵育1h;TBST漂洗30min;ECL显色.
6、同时以βactin蛋白为内参照.EM培养基培养长至60%密度时,镜下观察见细胞贴壁良好,以无血清DMEM洗3遍,每孔再加入DMEM(无血清,含有不同浓度genistein)1mL,继续孵育48h,收集培养上清液并活细胞计数,以3000r/min,离心5min去除细胞碎片,以细胞数为依据调整体积,分装后立刻进行酶谱分析或冻存于-80℃备用.1.2.4明胶酶谱活性分析将细胞条件培养液上样于100g/LSDS聚丙烯酰胺凝胶(胶中含1g/L的明胶,明胶是IV型胶原酶底物),4℃条件下,浓缩胶90V,分离胶140V恒压电泳,电泳后,将凝胶于含有25mL/LT
7、ritonX-100的洗脱液内振摇洗涤3次,每次30min.孵育液(50mmol/LTriscl,5mmol/LCaCl2,0.2g/LZnCl2,pH7.5)内37℃孵育18h;1g/L考马斯亮蓝R250染色,300mL/L甲醇、100mL/L乙酸脱色,干燥保存.为了尽量避免误差,每组细胞均设3个以上平行样本,并经多次重复实验.1.2.5计算机图像分析运用德国产LEICAQ550IDAMB231细胞侵袭能力的影响侵袭实验结果显示,实验组与对照组细胞均能够侵袭至铺有Matrigel滤膜上(图1).24,48,72h3个时间点上的侵袭细胞数,gen
8、istein15μmol/L组为(245±12)个,(300±20)个,(378±18)个;3
此文档下载收益归作者所有