rkip对体外胆管癌细胞侵袭的影响

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1、河北医科大学硕士学位论文RKIP对体外胆管癌细胞侵袭的影响姓名：时军利申请学位级别：硕士专业：内科学指导教师：姜慧卿201203中文摘要RKIP对体外胆管癌细胞侵袭的影响摘要胆管癌(cholangiocarcinoma)是起源于胆管系统上皮细胞的恶性肿瘤，是继肝癌之后的第2大肝胆系统肿瘤，胆管癌发生常见于中老年人，男性略多于女性。胆管癌早期缺乏特异性的临床表现，肝外胆管癌在中晚期才会出现典型黄疸症状，肝内和肝外胆管癌的早期就诊率很低，所以治疗效果也不尽人意，严重影响了人类的健康与寿命。与大多数肿瘤一样，胆管癌的发生是一个多步骤进

2、程，建立在机体本身遗传因素与环境因素相互作用的基础之上。在胆管癌的发生发展过程中，由于胆管上皮细胞的慢性损伤，通过自身增殖信号激活、抗生长信号丢失，逃脱凋亡，无限复制、血管异常增生等多个步骤，最终导致胆管癌的发生与浸润、转移。Raf激酶抑制蛋白(Rafkinaseinhibitorprotein，RrdP)是磷脂酰乙醇胺结合蛋白家族(phosphatidylethanolalmine．bindingproteins，PEBPs)的成员之一，广泛存在于不同种属。它参与多种信号转导通路的调节，被认为能抑制Raf-MEKl／2．ERK

3、l／2和NF．rd3信号转导途径，还通过抑制G蛋白偶联受体激酶．2(GPCR-2)来发挥受体信号调节器的作用。最近多项研究发现，RKIP与肿瘤关系密切，参与肿瘤的发生及发展。RKIP在大多数肿瘤中低表达，调控肿瘤细胞的生长、凋亡、浸润及转移等多种生物学行为，但RKIP对各种肿瘤细胞生物学行为的影响及其机制需进一步研究。我们将就RKIP对胆管癌细胞增殖、凋亡、侵袭及迁移的影响及机制进行研究。目的：我们利用过表达的RKIP，靶向RKIP的RNA干扰重组腺病毒的构建，探讨RKIP过表达及低表达对胆管癌细胞株RBE的增殖、凋亡、侵袭及迁

4、移能力的影响，探讨RKIP对RBE细胞生物学行为影响的机制，是否通过Raf／MEK／ERK信号转导通路介导产生。方法：细胞增殖行MTT及BrdU掺入法分析；通过流式细胞术、透射电镜技术及TUNEL技术检测细胞凋亡；通过体外细胞侵袭实验检测RBE细胞的侵袭能力；通过伤口愈合实验检测细胞的迁移能力。通过Westernblot方法分析RKIP、p-RKIP、Raf、p-Raf,ERK、p-ERK、GRK2及GAPDH蛋白的表达。中文摘要结果：(1)MTT结果显示，与control组比较，RKIP．RNAi．AID、NC．RNAi．GF

5、P．AD、RKIP．AD及GFP．AD各组的细胞活力在不同时间点无差异。(2)BrdU检测结果显示，与control组相比，各组细胞增殖率无差异。(3)Annexin-V／PE联合标记流式细胞术检测结果显示，重组腺病毒转染RBE细胞48h后，与Control组(0．000／硅0．oo％)相比，各组凋亡率均无差异。(4)TUNEL检测结果显示，在腺病毒感染RBE48h后，各组凋亡细胞极少且各组之间无差异。(5)透射电镜结果显示，RKIP．AD组与Control组均未见凋亡细胞。(6)细胞侵袭实验显示，与control组相比，GFP

6、—AD组、NC-RNAi．GFP．AD组RBE细胞侵袭力均无差异(60．67+22．02．52．67+16．621"854．33+16．21)，RKIP．RNAi-AD与NC．RNAi．GFP-AD组相比，侵袭力明显增加(115．00-a：18．30Ⅷ52．67+16．62)，P<0．05；RKIP．AD与GFP．AD组相比，侵袭力明显下降(17．00+6．48w60．674-22．02)，P<0．05。(7)伤口愈合实验结果显示，12小时之后感染RKIP—RNAi—AD的RBE细胞已经重新融合86％，而NC．RNAi．GFP．

7、AD组融合率只有71．6％，两组有统计学意义，P<0．05。RKIP．AD组RBE细胞的伤口愈合率明显降低，只有53．13％，而GFP．AD组愈合率为74．13％，两组之间有统计学意义，P<0．05。(8)Westernblot检测RKIP蛋白的表达情况，结果显示，与GFP—AD组相比，RKIP．AD组大量表达RKIP异位蛋6(2．77+0．95wO．85士0．44)，与NC．RNAi．GFP．AD组相比，RKIP—RNAi．AD组RKIP表达下降(O．26+0．17坩O．88+0．37)，与control组相比，GFP．AD组

8、及NC．RNAi．GFP．AD组均无差异。(9)Westernblot检测Raf及ERK的磷酸化水平显示各组均未见差异。(10)Westernblot检测GRK2蛋白的表达情况，结果显示，与GFP．AD组相比，RKIP．AD组GRK2的表达降低(O．41：L0．