脱细胞脊髓天然支架的制备及形态学观察

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1、脱细胞脊髓天然支架的制备及形态学观察作者：郭树章　任先军　蒋涛　吴波【摘要】　　［目的］采用化学脱细胞方法去除细胞和髓鞘成分制作细胞外基质支架，为桥接脊髓损伤缺损提供理想的天然神经支架。［方法］取SD大鼠胸段脊髓约2cm，运用冻融+化学萃取（3%脱氧胆酸钠和1KU/mlDNasEi、RNaseA）的组织工程学方法处理大鼠脊髓组织，并对处理后的脊髓支架分别进行组织学检查，了解脱细胞情况及细胞外基质支架形态。［结果］经过脱细胞处理后，光镜下HE染色脊髓横断面呈网状结构，未见细胞成分存留，纵切面上呈互相交错的管状通路；未见轴突、髓鞘和细胞核

2、。髓鞘染色可见髓鞘脱除彻底，未见髓鞘成分。［结论］本实验采用冻融+化学萃取的组织工程学方法可制备出理想的天然脊髓支架，该支架与脊髓三维组织结构具有高度相似性，有望作为脊髓损伤后桥接物和神经组织工程种子细胞的支架,本实验结果显示3%脱氧胆酸钠和1KU/mlDNasEI、RNaseA进行脱细胞处理两次是较为合适的，能较为彻底去除细胞及髓鞘成分并较为完整地保留细胞外基质的三维结构。【关键词】脱细胞脊髓组织工程支架大鼠　　Preparationofacellularscaffoldofnaturalspinalcordandobservati

3、onofmorphology　　Abstract：［Objective］Usingaprocedureofchemicalagenttoremovethecellsandmyethininspinalcordofratandtopreparethescaffoldofextracellularmatrix,soastoobtainanidealnaturalspinalcordscaffoldtobridgethenervegap.［Method］Ratspinalcordethodoffreezethaicalextraction（

4、3%sodiumdeoxycholateand1KU/mlDNaseI，RNaseA）.HistologyatrixyethinandaxonsdisappearedafterthespinalcorddeoxycholateandDNaseI，RNaseA.Typicalptytubesethoddesignedinauthorsexperiment.Thisscaffoldhassimilarthreedimensionalstructurealspinalcord,planttheseedingcellsinspinalcor

5、dtissueengineering.Theexperimentindicatesthatcellsandmyethincanberemovedandthethreedimensionalstructurebereservedbychemicalextractiondeoxycholateand1KU/mlDNaseI，RNaseA.Chemicalextractionisanidealmethodtopreparetissueengineerscaffoldofspinalcord.　　Key。PBS缓冲液清洗，去除表面血迹，参照R

6、ibatti等〔1〕方法并加以改进：(1)脊髓置于-80℃深低温冰箱中冻存1h，室温下解冻；(2)将脊髓组织置于蒸馏水内，在室温下浸泡6h，每2h换液1次；(3)置于3%的脱氧胆酸钠盐蒸馏水溶液（加入适量1mol/LNaOH至溶液pH值为8～9）连续震荡4h（恒温回旋振荡器内持续振荡，25℃100转/分）；(4)蒸馏水中振荡浸泡3h，1h换液1次；(5)置于1KU/mlDNase和RNase混合液中持续振荡30min；(6)蒸馏水浸泡3h，1h换液1次;(7)重复(3)～(6)再萃取1遍，最后将萃取后的脊髓组织置于冷冻干燥机中冻干，6

7、0Co照射消毒，照射剂量2.5Gy，消毒后-80℃冰箱保存。　　1.3组织学观察　　1.3.1HE染色　　将化学萃取的脊髓支架和大鼠正常脊髓用10%中性甲醛缓冲液固定，常规石蜡包埋，两种标本均行横切片和纵切片，切片后进行HE染色，光镜观察。　　1.3.2髓鞘染色(，脱蜡至水，in（10%纯酒精性苏木精5ml，4%铁明矾50ml，蒸馏水45ml），自来水洗15min，4%铁明矾分化至灰白质分辨明显，必要时用l），自来水洗，脱水，透明，封片，光镜观察。　　2结果　　2.1肉眼观察　　在脱细胞、蒸馏水浸泡过程中可见大量白色絮状物自脊髓内析出

8、，脱细胞处理的脊髓支架颜色呈乳白色，半透明状，仍维持圆柱形，粗细为处理前的2/3～4/5，略变短。强度略有下降，韧性与处理前脊髓组织相似，黏性略有增加。　　2.2HE染色　　正常大鼠脊髓横切面结构，含有大量神经元和胶质细