我国弓形虫病核酸疫苗研究概况

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1、我国弓形虫病核酸疫苗研究概况关键词：弓形虫病　　StatusintheresearchofnuclEicacidvaccineagainsttoxoplasmainChina.　　　　刚地弓形虫（简称弓形虫）呈世界性分布，哺乳动物及鸟类普遍易感。人类对弓形虫有较强的自然免疫力，感染后绝大多数无明显症状表现，或只出现亚急性弓形虫病。但在孕妇及免疫功能低下者（如ADIS病、器官或组织移植后接受免疫抑制剂治疗的病人等）感染弓形虫后引起的危害严重。人体弓形虫感染日益受到关注，弓形虫病疫苗成为当前研究的热点。动物实验发现，弓形虫全虫疫苗，弓形虫特异抗原组分疫苗有预防弓形虫感

2、染或降低感染度作用，但前者可能会引起再感染，后者的免疫保护效果较差。弓形虫病核酸疫苗克服了上述疫苗存在的不足，具有良好的开发应用前景。我国从上世纪90年代后期开始了弓形虫病核酸疫苗的研制，通过对表达保护性抗原蛋白基因进行重组，先后研制出弓形虫基因单价疫苗、复合疫苗和混合疫苗。动物实验证明部分疫苗具有良好的免疫预防效果。　　1保护性抗原及目的基因研究　　弓形虫裂殖了表面膜蛋白（SAG）［1，2］，致密颗粒蛋白（GRA）［3］和棒状体蛋白（ROP）［4］是重要的弓形虫抗原，这些抗原物质与弓形虫的侵袭性有关，且能诱导宿主的免疫反应。　　1.1SAGSAG是弓形虫裂殖子表

3、面膜蛋白。通过对SAG的分子结构、生物学和免疫学特性研究发现，有5种（分别命名为P22、P23、P30、P35利P43）与弓形虫病免疫有关。　　1.1.1P30（SAGl）P30分子质量30～35kDa含量约占虫体总蛋白的3%～5%，主要存在于弓形虫表膜及内膜系统，也可分泌到虫体外环境。P30是重要的弓形虫表面膜蛋白，与虫体的吸附和入侵有关，能被弓形虫急性感染期及恢复期血清抗体识别。动物实验证明，用纯化的P30蛋白免疫小鼠可显著提高小鼠抗弓形虫感染能力［5］。为提高免疫效果，于瑾等［6］构建了含有霍乱毒素A2/B亚基基因和P30基因的重组表达质粒，转化宿主菌BL2

4、l后经IPTG诱导产生30-CTA2/B融合蛋白。游东生等［7］将P30重组表达质粒转化入DH5α，l09中成功表达了分子质量为70kDa融合蛋白，该蛋白能为谷胱甘肽S转移酶（GST）单克隆抗体及弓形虫感染的兔血清所识别。　　1.1.4P23与其它弓形虫表面腆蛋白不同，P23不是GPI锚定蛋白，P23的N端连接有糖基化位点，是慢性弓形虫病的一个分子标志。疫苗研究发现，24kDa的多肽物质能诱导产生一定的免疫保护力。用24kDa多肽免疫动物后，在该动物血液中检测到了抗P23抗体［12］。闪此认为P23可能包含该多肽的免疫表位，其基因序列可能存在同源性。是有希望的弓形

5、虫病疫苗候选基冈。　　1.2GRA弓形虫致密颗粒秆放多种蛋白（GRA），已经报道的有8种，其中研究较多的有GRAl、GRA4、GRA6手GRA8。　　1.2.1GRAlGRAl是慢性弓形虫病的标志性抗原分子。研究表明，GRAl可诱导免疫动物产生以IFN-R升高为特征的保护性细胞免疫应答。彭碧云等［13］将构建的GRAl基因重组质粒用脂质体介导，转染到小鼠巨噬细胞RA和IgG血清所识别。　　1.2.4GRA7GRA7为分子质量29kDa的致密颗粒蛋白，在弓形止速殖子、包囊及肠内期虫体均有分布。PCR分析表明，不同地理株弓形虫GRA7基因均具有保守性［17］。重组表达

6、质粒pGEX-4T—I/GRA7转入大肠埃希菌BL21后经IPTG诱导，表达的GST融合蛋白具有GRA7的抗原性［18］。　　1.2.5GRA8一般认为，GRA8分子为弓形虫致密颗粒分泌蛋白。但Beghetto等［19］报道GRA8可能是P35。为研究GRA8的抗原性和制备高效的弓形虫核酸疫苗，袁仕善等［20］参照GRA8序列设计引物，采用PCR从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出编码GRA8的基因片段，分别亚克隆到原核表达质粒pGEX-4T-2和真核表达载体pVAXl上，经SDS-PAGE和免疫印迹分析结果表明致密颗粒抗原GRAS的原核表达质粒在大肠杆菌中表达了G

7、RA8的融合蛋白，分子质量为41kDa:用提纯的真核重组表达质粒免疫小鼠（后腿肌肉注射，每周1次，每次50μg，连续2周），4周后检测证实免疫鼠产生了抗弓形虫抗原的抗体，ELSA滴度1:100。杨慧龄等［21］构建的pcDNA3.1（+）-GRA8重组质粒经PCR鉴定利测序分析，与GENEBANK相应基因序列完全一致。　　1.3ROP弓形虫棒状体可分泌棒状体蛋白（ROP），这些蛋白物质的产生与弓形虫入侵宿主细胞有关。已报道的棒状体蛋白有8种，国内研究较多的为ROP1利ROP2。　　1.3.1ROP1ROP1蛋白为单拷贝的ROP1基因表达产物，该蛋白物质能影响宿主细

8、胞的通透性