外周血ck20 mrna的表达与大肠癌诊断、分期及预后的研究

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1、外周血CK20mRNA的表达与大肠癌诊断、分期及预后的研究【关键词】大肠癌角蛋白逆转录聚合酶链式反应　　0引言　　我们利用RTPCR技术检测了126例大肠癌患者外周血单个核细胞CK20mRNA的表达情况,研究CK20mRNA的表达在大肠癌中的临床意义。　　1资料与方法　　1.1研究对象　　1.1.1大肠癌组经手术后病理证实的大肠癌患者126例，男75例，女51例，年龄38～73岁，平均57.4岁；按Duke’s分期：A期23例、B期34例、C期44例、D期25例。术前采集外周血。　　1.1.2正常对照组健康志愿者

2、25例，男17例，女8例，年龄29～58岁，平均46.5岁。　　1.1.3细胞株组①HT29细胞株（结肠癌细胞株）；②H740细胞株（肝癌细胞株）；③2HTB133（乳腺癌细胞株）；④TPG5（肺癌细胞株）；⑤K562细胞株（红白细胞病细胞株）；⑥SGC7901（胃癌细胞株），常规细胞培养。　　1.1.4其他癌症组胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、食管癌各10例。　　1.2方法　　1.2.1样品的采集和保存　　（1）血标本的采集采取大肠癌患者及正常献血员外周静脉血10ml，放入20u/ml肝素处理的防凝试管内，分离出单个核细胞，

3、放入80℃冰箱保存备测。　　（2）实体瘤标本的来源大肠癌组织及其他癌症取自大肠癌和其他癌症病人手术后癌组织。标本30min内送实验室，新鲜提取总RNA；不能保证30min内制备的样品，在留取后放80℃冰箱保存备测。　　1.2.2CK20mRNA的测定用RTPCR法。总RNA的提取：以酸性硫氰酸肌苯酚氯仿一步法提出总RNA，80℃保存待测。逆转录（RT）反应：于DEPC处理的Eppendorf管中，加入总RNA，MMLV，随机引物，逆转录反应体系，快速离心混匀。37℃1h，95℃10min灭活MMLV。快速离心

4、使蒸气沉于管底。PCR反应：于0.5mlEppendorf管中，加入RT反应产物，PCR反应体系，CK20上游引物（5’CAGACACACGGTGAACTATGG3’）1μl，CK20下游引物（5’CAGACACACGGTGAACTATGG3’）1μl，扩增片段长度为370bp；βactin上游引物（5’GTGGGGCGCCCCAGGCACCA3’）1μl，βactin下游引物（5’CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC3’）1μl，扩增片段长度为500bp。95℃5min，离心使蒸气沉于管底。加入Taq

5、DNA聚合酶，快速离心混匀。循环条件：94℃1min，58℃1min，72℃1min。循环35次，末次延长7min。电泳鉴定，观察目的基因，实验中仅出现一条500bpβactin带，为CK20mRNA阴性；同时出现370bp带，为CK20mRNA阳性。　　1.3随访对18例Duke’sA患者、23例Duke’sB患者、28例Duke’sC患者进行了随访，内容主要观察远处转移情况。　　1.4统计学处理用POMS2.00版医学统计软件包进行数据处理，用χ2检验。　　2结果　　2.1CK20mRNA的表达情况　　细胞株：

6、仅HT29、SGC7901细胞株阳性，其余细胞株均阴性；25例健康志愿者：外周血CK20mRNA均为阴性；126例大肠癌中69例阳性，阳性率54.8%；其他癌症组：仅胃癌组织阳性，其余癌组织均阴性。　　2.2Duke’s分期126例大肠癌患者外周血CK20的表达情况　　各分期CK20mRNA表达的阳性率分别为：Duke’sA期21.7%，B期32.4%，C期63.6%，D期：88%。各分期比较：A期与B期比较χ2=1.948，P<0.05；与C期比较χ2=2.346，P<0.01；与D期比较χ2=10.6

7、05，P<0.01。B期与C期比较χ2=2.806，P<0.01；与D期比较χ2=7.421，P<0.01；C期与D期比较χ2=4.343，P<0.01。　　2.3随访情况　　Duke’sC期的患者在术前和术后的治疗差异极大，完成随访（12～52月）并且可以评价的患者20例，11例CK20mRNA阳性的患者中有6例（54.5%）发生了远处转移，而9例CK20mRNA阴性的患者中有3例（33.3%）发生了远处转移，两者比较χ2=1.421，P>0.05，出现这种结果的原因可能是由于Duke’

8、sC期术后的治疗差异极大；Duke’sB期患者术后常规给予4个周期的“DF方案”化疗，完成随访（12～57月）并且可以评价的患者23例，8例CK20mRNA阳性的患者中有5例（62.5%）发生了远处转移，而15例CK20mRNA阴性的患者中有3例（20%）发生了远处转移，两者比较χ2=7.803，P