CK19mRNA在大肠癌患者外周血中的表达及临床意义

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1、CK19mRNA在大肠癌患者外周血中的表达及临床意义作者：赵红强王前安泽武郑兴学王鹏陈治齐洪峰梁冲强赵冠【摘要】目的探讨CK19mRNA在大肠癌患者外周血的表达及临床意义。方法应用巢式RT-PCR技术检测20例健康人、20例大肠腺瘤疾病患者和90例大肠癌患者外周血CK19mRNA的表达。结果健康人中CK19mRNA不表达，大肠良性腺瘤疾病患者外周血中CK19mRNA有1例表达，表达率为5%，大肠癌患者外周血中CK19mRNA有53例，表达率为58.9%，CK19mRNA表达率与肿瘤分期，瘤细胞的分化程度，肿瘤转移有显著相关性(均P<0.05)。结论C

2、K19mRNA作为检测大肠癌患者外周血微转移的分子标记物具有良好的敏感度和特异性同时CK19mRNA可作为判断大肠癌患者的预后的指标。【关键词】大肠癌;外周血;CK19;巢式RT-PCR　细胞角蛋白(CK)来源于上皮组织，是真核细胞的细胞骨架中间丝蛋白，广泛表达于上皮组织细胞中，而在间叶组织中缺乏表达〔1〕。CK19是CK家族的重要成员之一，起源于上皮组织的大肠癌保留着某些上皮组织特异性标记物的表达，而间叶组织中一般无上皮组织标记物表达〔2〕。本研究采用巢式RT-PCR技术检测CK197mRNA在大肠癌患者外周血中的表达与Dukes分期、肿瘤细胞分化程度、

3、血管生成、微转移和复发之间的关系。　　1材料与方法　　1.1研究对象随机选择2006年4月至2007年2月在我院普外科住院治疗的大肠癌患者90例，入选条件：①术前无放、化疗;②术后病理证实为管状腺癌或乳头状腺癌。健康志愿者20例，大肠良性腺瘤患者20例。　　1.2临床资料90例大肠癌患者，年龄在35～65岁，中位年龄53岁，手术分期Dukes分期标准，其中A期19例，B期20例，C期40例，D期11例,管状腺癌50例，乳头状腺癌40例，按分化程度分为高分化13例，中分化57例，低分化20例。　　1.3引物设计参照GenBank，利用PrimerPremie

4、r5.0引物设计软件进行引物设序列见表1，由北京赛百盛公司合成。　　1.4标本收集及总RNA提取抽取约4ml新鲜血弃去前2ml以防抽血过程中上皮细胞污染，留取2ml于EDTA抗凝管中，红细胞裂解液裂解红细胞，分离有核细胞，采用Trizol试剂(Invitrogen公司)抽提总RNA。样本中加入1mlTrizol试剂反复吹打使细胞裂解，加入200μl三氯甲烷剧烈震荡，冰上静置2~5min，1200007r/min离心15min，小心抽取上清放EP管中，加入等体积的预冷异丙醇与-20℃静置20min，120000r/min离心10min，可见管底有白色沉淀即是

5、RNA，弃去上清加入无核酸酶75%乙醇洗涤RNA沉淀，充分晾干加入DEPC水溶解RNA，所得的RNA溶液用RNase-freeDNaseI(Fermentas公司)处理以去除可能存在的DNA基因组污染，-80℃冰箱保存。表13种目的基因的引物序列及产物大小　　1.5cDNA合成及巢式RT-PCR扩增使用cDNA合成试剂盒(Fermentas公司)根据所测RNA浓度加入2μgRNA总反应体系为20μl，按照说明完成cDNA第一链，巢式RT-PCR扩增条件，第1轮：94℃1min,65。C50s,72℃　2min,72℃40s循环5次;94℃50s,67℃50

6、s,72℃2min,72℃40s,循环25次;72℃终延伸10min。第2轮：94℃50s,72℃2min,循环30次;72℃延伸10min。所用反应体系为25　μl，使用2×TaqPCRMasterMix(天根公司)PCR反应体系：cDNA2.5μl，Primer(10μmol/L)1,2各1μl，2×TaqPCRMasterMix12.5μl，DEPC水8μl。　　1.6灵敏度测试使用大肠癌细胞株A544，由中南大学湘雅医学院提供，所测灵敏度可达106。　　1.7统计学方法使用SPSS11.5统计软件进行χ2检验。7　　2结果　　2.1总RNA鉴定实验

7、中抽取RNA，OD260/280值在1.78~1.99之间，于1%琼脂糖凝胶中电　泳分析EB染色，凝胶成像系统中成像可见28S,18S条带清晰可见，见图1。　　2.2巢式RT-PCR检测结果见图2。图1部分总RNA标本的琼脂糖凝胶电泳图2部分患者外周血CK19巢式RT-PCR的检测　　2.3健康人、大肠良性腺瘤患者和大肠癌患者外周血中CK19mRNA的表达情况20例健康人外周血中无CK19mRNA表达，20例大肠良性腺瘤患者外周血中1例CK19mRNA表达，表达率为5%，90例大肠癌患者外周血中53例CK19mRNA表达，表达率为58.9%。大肠癌患者外周

8、血中CK19mRNA表达率明显高于健康人和大肠良性腺瘤患者(χ2=