提高胚胎胰岛冷冻保存质量的实验研究

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1、提高胚胎胰岛冷冻保存质量的实验研究作者：于江　董汉光　李光华　信明军　王一　许评【摘要】目的：研究三维组织细胞旋转培养系统（RCCS）对胚胎胰岛冷冻保存复苏后质量的影响。方法：将胚胎胰岛平均分为实验组1、2和对照组，实验组1、2冷冻保存胰岛，冷冻保存前后分别用RCCS培养和普通培养，对照组经RCCS培养新鲜胰岛。切取胚胎胰腺，经胶原酶V消化、纯化，培养3d，然后进行标准冷冻保存，复苏后继续培养，并检测各组胰岛数量及活性。结果：纯化后每个胚胎收获胰岛最多5115.43IEQ，最少2331.98IEQ，平均（3551.27±25

2、3.76）IEQ。实验组1胰岛细胞存活率、胰岛素释放量、胰岛素刺激指数均高于实验组2。结论：RCCS培养有利于胰岛细胞的生长繁殖，使其具有更好的分泌胰岛素能力，该方法同胰岛冷冻保存相结合，可以进一步提高胰岛的冷冻保存效果，为胰岛库的成功建立探索出一条新的途径。【关键词】失重·细胞培养技术·胰岛移植·低温保存·胚胎胰腺　　【ABSTRACT】Objective:Tostudytheimpactofrotarycellculturesystem（RCCS）onthequalityandactivityoffetalisletso

3、fpancreasaftercryopreservationandresuscitation.Methods:Thefetalisletsofpancreasentgroup1,2andcontrolgroup.Inexperimentgroup1and2,fetalisletsofpancreasonculturerespectively.I1640培养基，胎牛血清（FBS），二甲基亚砜（DMSO），放射免疫分析药盒（RIA），RCCS等。　　1.3实验方法　　1.3.1　实验分组及处理　　　收集胰岛悬液分为54份，平均分

4、为3组。实验组1：将胚胎胰岛在RCCS中培养3d后，悬浮于4℃低温保存液（histidine-tryptophan-ketogluratesolution，HTK液）中，放置30min后进行冷冻保存步骤；冷冻保存30d后复苏，继续在RCCS中培养30d。实验组2：胚胎胰岛冷冻保存前后均在普通培养基中培养，培养时间同实验组1。对照组：新鲜胚胎胰岛在RCCS中培养30d。　　1.3.2　人胚胎胰岛细胞分离、消化和收集　　　取腹部十字切口达腹腔。将胰腺连同脾脏全部切除，精细修剪胰腺被膜组织。将胰腺置于盛有2mL（1.5mg/mL）

5、胶原酶V的烧杯中，剪切成0.5mm3大小的组织块后，移入50mL锥形离心管，再加入8mL胶原酶V于37℃水浴振荡（250次/min）、消化。加入4℃完全培养基20mL（含20%FBS、10mmol/LHEPES、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、5mg/mLDNaseⅠ）终止消化。离心，弃上清，重新加入4℃完全培养基20mL，吹打、混匀胰岛悬液。重复上述过程，然后将胰岛悬液在网眼直径为0.4～0.5mm的钢网下滤过，收集滤过液，取100μL经DTZ染色后计数。　　1.3.3　冷冻保存　　　实验组胰岛细胞分别在微重

6、力条件下或普通培养条件下培养72h后，将胰岛以同样数量悬浮于4℃HTK液中，一次加入DMSO至终浓度为2.0mol/L，在4℃条件下放置30min，然后进行标准冷冻保存。标准冷冻保存步骤：将各样品在-7.5℃含95%乙醇的沉降管中作用5min，过渡冷却到-7.5℃。为确保所有冷冻保存管降温一致，轻轻晃动，使冷冻保存液中的胰岛悬浮。采用核晶形成步骤：将一根从液氮中取出来的金属杆接触到各冷冻保存管外缘的弯月液面部分，然后将样品温度回升到-2.5℃（约DMSO的冰点）5min，估计融合的潜在热量已经释放出来，将各冷冻保存管再次放入

7、沉降管（0.8mL）中-7.5℃保存，放置10min。当所有样品冷冻保存后，将样品以0.25℃/min的速度缓慢冷却到-40℃。然后投入到液氮中保存。　　1.3.4　胰岛冷冻保存后复苏、培养　　　将冷冻保存样品自液氮中取出，在37℃水浴中以200℃/min的速度快速解冻。1500r/min离心5min，离心半径21cm，去除上清，加入1mL0.75mol/L的蔗糖在冰上作用30min，然后以冷Hanks液倍比稀释（加入1mLHanks液作用5min，再加入2mLHanks作用5min，最后加入4mLHanks液作用5min）

8、。离心后，弃上清，将胰岛重悬于完全培养基中，置于37℃、含5%CO2培养箱中孵育过夜。　　1.3.5胰岛计数及活性检测　　冷冻保存前后对胰岛悬液进行微生物学检测。DTZ染色对胚胎胰岛进行计数。AO-PI染色检测胰岛细胞活性。冷冻保存复苏后胰岛存活率用胰岛活细胞占所有胰岛细胞总数的百分比表示