高产奶牛胚胎冷冻保存的研究.pdf

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1、学术论坛ScienceandTechnOIOgyInnov高产奶牛胚胎冷冻保存的研究马博(澳西姆生物技术有限公司广东深圳518000)摘要：利用FSH+PGF2，以非手术方法采得7—9日龄超排黑白花奶牛(20头)胚胎65枚。应用CL-5500冷冻仪，采用乙二醇作保护荆冷冻奶牛胚胎，其中42枚胚胎用于一步冷冻试验，水浴解冻后共回收39枚胚胎。关键词：一步细管法冷冻胚胎奶牛中图分类号：s8l4文献标识码：A文章编号：1674-098X(2OO8)lO(a)-O195一O1胚胎的冷冻保存技术不仅为动物种质资保护剂液内，孵育7min，再用P

2、BSS洗2遍。胚胎冷冻采用的冷冻保护剂，对胚胎具有源保存和良种家畜的国际交流提供了简单有在倒置显微镜下观察胚胎的形态、色调、卵一定的毒害作用，因此，在胚胎解冻后必须尽效的手段，还是胚胎移植、转基因和生物胚胎裂球或细胞团的密度和均匀度、透明带间隙快除去【5J。传统的脱除方法是用保护剂浓度克隆技术不可分割的重要组成部分，也是胚胎清晰度等，判定胚胎冷冻解冻后的质量变化，递减法逐渐稀释，最终移至无保护剂的培养液移植技术真正走向商业化的关键技术。目前，并作形态学评定。中，现多用非渗透性物质(如蔗糖)除去冷冻保家畜胚胎移植技术现已广泛应用到生产

3、实践1．3冷冻效果护剂f6】。本实验即是采用此法，取得良好效中。1984年，Takeda等将小鼠胚胎室温脱水形态学观察：解冻后胚胎透明带完整、果。后直接投入液氮冷冻保存，解冻后囊胚发育率细胞结合较紧密、卵周隙适中、形态完整的胚实验证明，本法进行高产奶牛胚胎冷冻效为61％-65％_lJ。国内旭日干等先后一步冷冻胎为可用胚。果良好。形态学观察胚胎形态完好率89．大鼠、小鼠、家兔及山羊胚胎均获得成功【2_。荧光染色检查：将除去冷冻保护剂的胚胎74％(35／39)，冻胚荧光染色阳性率为88．89％本试验的目的是研究用乙二醇作为冷冻保护清洗后

4、移入含5LFDA染色液的2mLPBSS(8／9)，体外培养发育率为77．78％(7／9)，明显剂进行奶牛胚胎一步冷冻的方法，初步建立奶中，38．5℃孵育5min。用PBSS洗2遍，置玻优于其它冷冻剂，达到了很好的胚胎保存效牛胚胎一步冷冻保存的程序，探寻更好的高产片上，荧光镜下观察，计算荧光阳性率，以此反果。‘奶牛胚胎冻存方法。映冷冻胚胎的活力。体外培养：将清洗过的冻胚移入孵育好的参考文献1材料与方法TCM-199培养液中进行微滴培养(5％CO，，[1】TakedaT，ElsdenRP，SeidelJrG1，1材料385℃，饱和湿度)

5、，12h、24h分别观察培养E．Cryoprervationofmouseembryos供体牛：西北农业大学奶牛胚胎移植试验发育情况，计算胚胎体外发育率，以判定冻胚bydirectplung~intoHiguidnitrogen．站供体牛场饲养的成年健康黑白花奶牛，选择的活力。Theftogeno]ogy，1984．21：266．3～6岁，有较高生产性能，305天产奶量【2】旭日干，薛晓先．张链链等．大鼠早期胚胎8000kg以上，无遗传疾病，无流产史。2结果的快速冷冻保存．内量古大学学报．促卵泡素FSH，15-甲基PGF2(澳大利2

6、．1胚胎形态学观察1989．80(1)；126～131．亚)，胚胎冲洗液(含1％小牛血清的PBS)，胚胎其中42枚胚胎用于一步冷冻试验，水浴[3】王光亚，段恩奎．奶牛胚胎工程【MJ．天津出保存液PBSS(含2O％小牛血清的PBS)，乙二醇解冻后共回收39枚胚胎。用1．0mol／L蔗糖版社，l993．59—75．EG(澳大利亚)。除甘油液(含1．0tool／L蔗糖一步除去保护剂，胚胎形态完好率为89．74％【4】TadaN，SatoM，AmannE，eta1．A的PBSS)，胚胎培养液(含lO％小牛血清的(35／39)。simplea

7、ndrapidmethodforcryO～TCM一199液)，荧光染色液lmg／mLFDA2．2荧光染色检查preservationofmouse2-cellembryos的丙酮液)。将9枚形态完整胚胎进行荧光染色，经荧byvitrification：beneficialefectofsu～荧光显微镜(日本，Olympus)。CO，培养箱光显微镜检查，其中8枚呈阳性，l枚胚胎为阴cn)8eandmfinoseontheircryosurvival(美国，2300型)，实体显微镜(日本，Olympus)。性，冻胚荧光染色阳性率为88．

8、89％(8／9)。rate[J]．Thefiogeno1ogy，2003，40(2)13331．2方法2．3体外培养———344．超排与采胚：采用常规非手术冲胚法将9枚形态完整胚置于TCM-199液中微【5】刘伯宗，王光亚．山羊胚胎一