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1、摘 要:哺乳动物胚胎冷冻保存效果受从稀释液和冷冻保护剂、冷冻前处理、冷冻剂型、冷冻速率、解冻等方面的因素。,其中冷冻方法是一个关键性因素。目前胚胎冷冻方法主要有常规慢速冷冻法和玻璃化冷冻法两种。常规慢速冷冻法是指利用甘油、乙二醇等做冷冻保护剂通过缓慢降温的方式进行胚胎冷冻;玻璃化冷冻法是指利用高浓度的冷冻保护剂通过快速降温的方式进行胚胎冷冻。与常规慢速冷冻法相比,玻璃化冷冻法简化了操作过程,大大缩短了操作时间,不需昂贵的程序控制冷冻仪。关键词:胚胎;冷冻保存;冷冻保护剂;冷冻;解冻,玻璃化胚胎冷冻保存[1]是指通过特殊的保护措施和降温程序,使
2、胚胎在-196℃条件下停止代谢,而升温后又恢复代谢能力的一种技术。一般指0～-80℃的温度下保存胚胎,而超低温冷冻保存则是在极低的温度(液氮-196℃、液氦-269℃)下保存动物胚胎.处于超低温下的胚胎,其新陈代谢几乎完全暂时停止,因而可以达到长期保存的目的[2]。1972年Whittingham[3，4，5]等首次在超低温条件下成功地冷冻保存了小鼠胚胎,解冻后移植产下后代。由于这种方法的诞生引来了很多的人的注意，此后,许多学者对哺乳动物胚胎冷冻保存进行了大量的研究,取得了大量研究成果,牛(Wilmut&Rowson,1973)、家兔(Whi
3、ttingham&Adams,1976)、大鼠(Whittingham,1975)、山羊(Biltonetal.,1976)和绵羊(Willadsenetal.,1976)等动物的胚胎超低温保存也相继取得成功.1977年Willadsen等[6]对上述方法进行了改良,发明了快速冷冻法,将冷冻降温时间缩短了1h.1985年Rall等[7]首次发明了玻璃化冷冻法,对小鼠8细胞胚胎冷冻保存取得成功.随后经研究者的不断改进,使这项技术日趋成熟,部分动物胚胎经玻璃化冷冻后已在生产中示范应用,有望在生产实际中得到推广，本文对哺乳动物胚胎冷冻保存技术的最新
4、研究进展加以综述。1 冷冻保护剂的种类 抗冻保护剂(Cryoprotectiveagents,CAP)也就是冷冻保存剂是指可以保护细胞抵抗低温或超低温时对细胞产生的损害,如细胞结冰、脱水、溶质浓度提高和蛋白质变性及其骨架结构的损伤等的一类化合物。1.1抗冻保护剂[8] 主要包括丙三醇(glycer-ol)、二甲基亚砜(dimethylsulphoxide,DMSO)、丙二醇(propyleneglycol)、乙二醇(ethyleneglycol)、乙酰胺(acetamide)、甲醇(methylalcohol)和丁二醇(butadiene)等
5、。又称细胞内液抗冻保护剂,这类保护剂分子量小,能够保证细胞内水分的及时脱出,而且还能降低溶液的凝固点,这样使胚胎有更多的时间把细胞内的水分脱出,避免细胞内形成冰晶。并通过与胚胎的平衡,替换出细胞内的部分水分,这样降低细胞内形成冰晶。但是它们对胚胎有毒害作用,尤其在高浓度或高温下毒害作用更大。各种渗透性抗冻保护剂对胚胎的保护作用机制基本是相同的,但它们的毒性和渗透性有很大差别,因此在玻璃化冷冻的胚胎存活率上效果不同。关于不同种类的抗冻保护剂的渗透性和毒性,Leibo用毒性相对较低的Gly和EG对牛胚作对比研究发现,EG对细胞的渗透性强。Kasa
6、i等用30%(v/v)浓度抗冻保护剂处理小鼠桑椹胚30min,观察对生存率影响实验的结果表明,乙二醇的化学毒性最小,其次是丙三醇、DMSO、丙二醇,乙酰胺毒性最高。另外,对不同发育时期的胚胎来说,抗冻保护剂的毒性也不尽相同。1.2分子量非渗透性抗冻保护剂 低分子量非渗透性冷冻保护剂是胚胎冷冻液中的另一个关键性成分。其主要指糖类,如单糖(葡萄糖、果糖、山梨醇和甘露醇)、二糖(蔗糖、海藻糖)和多糖(棉子糖),目前应用最广泛的是蔗糖。糖类除了能通过提高渗透压来促进细胞脱水外,还能保持细胞结构的完整。同时,糖类能减少达到玻璃化所需的渗透性冷冻保护剂的
7、浓度,这两个特性均可降低冷冻保护剂对胚胎的毒害作用。此外,糖类还可以作为渗透压缓冲物质,其通过减少解冻时细胞的膨胀速度和程度来减少渗透性损伤的发生。这类冷冻保护剂在低温下对胚胎无毒害作用,但是温度升高时却有毒害作用。1.3 大分子物质常用的大分子物质主要有聚乙二醇(PEG)、聚蔗糖(Ficoll)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)、透明质酸钠、葡聚糖等聚合物。这类冷冻保护剂比渗透性冷冻保护剂毒性低,并且有促进玻璃化的作用,能部分替代渗透性冷冻保护剂,降低冷冻液的毒性。由于胚胎解冻时比冷冻时更易形成致死冰晶,因此克服解冻时形成致死冰
8、晶也至关重要,据报道,许多大分子物质,如聚乙二醇、聚蔗糖、透明质酸钠等具有阻止解冻时形成冰晶的作用。2 冷冻方法自从1972年Whittingham等首次采用慢速冷
