石斛属植物遗传多样性的简单重复间系列分析

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1、石斛属植物遗传多样性的简单重复间系列分析【摘要】　　目的研究我国石斛属植物间的亲缘关系。方法从55个ISSR引物中筛选出14个多态性好的引物对石斛属（Dendrobium）植物基因组DNA进行简单重复间序列（ISSR）分析。利用POPGENE32软件计算ISSR扩增产物的NEi's基因多样性指数（H）和Shannon信息指数（I），标记系统的有效等位基因数(effectivenumberofalleles,NE)。应用NTSYS（3.0）软件计算NEI's遗传距离和遗传相似系数。按照非加权平均距离法(UPGMA)构建聚类关系图。结果14条引物

2、共扩增出123条带，多态性带112条，约占总数的91.06%，平均每个引物扩增的DNA带数为8.79条。Nei's基因多样性指数（H）为0.3519，Shannon信息指数（I）为0.5282，有效等位基因数（NE）为1.5945，种间的相似系数介于0.0909～0.6957，平均为0.3779。结论我国石斛品种的遗传基础比较丰富，ISSR分子标记构建的亲缘关系树状图与经典分类系统基本一致。【关键词】石斛；简单重复间序列；遗传多样性　　Abstract：ObjectiveToprobetherelationshipamongDendrobiu

3、mspecies(Orchidaceae).Methods14primersorphismscreenedfrom55ISSRprimersorphicdataofDNAfragmentsbyUPGMA.ResultsTotally123bandsplifiedand112ofthemorphicaccountingfor91.06%.TheaveragenumberofDNAbandsamplifiedbyeachprimerationindex(I)andeffectivenumberofalleles(NE)ilarityamongal

4、lthetestedclonalcultivarsrangedfrom0.0909to0.6957,averaging0.3779,constructedolecularmakersicsystem.　　Key;ISSR;Geicdiversity　　石斛（DendrobiumSplesequencerepeat,ISSR）标记技术对28种石斛进行分析，以确定它们之间的遗传差异和种间亲缘关系，为石斛属植物系统学研究、种质资源的保护和利用提供科学依据与参考。　　1器材与方法　　1.1材料实验所用石斛植物采自我国石斛主产区：云南、安徽、广东、贵州

5、等省区的原始森林，现被整丛栽种于山东理工大学生命科学学院植物组织培养实验室，以便及时取材和观察（见表1），实验样品经开花鉴定。　　1.2仪器与试剂PCR仪（PTC-200,MJResearch,Inc,USA)；电泳仪（DYY-8C型；北京六一仪器厂）；电泳槽（DYCp-34A型；北京六一仪器厂）；HeraeusStratos离心机；Alpha2200凝胶成像系统。　　TaqDNA聚合酶、dNTPs和200bpDNAladder（北京天根公司），Agarose（Promega公司），CTAB（Sigma公司），溴化乙锭（Fluka公司），Tr

6、is-HCl（UltraPure）、EDTA和巯基乙醇（上海生工公司）。ISSR引物根据加拿大哥伦比亚大学(UBC)公布的序列，由上海生工生物技术服务有限公司合成。　　表1实验材料来源及采集地（略）　　1.3方法　　1.3.1总DNA的提取取各样品新鲜原植物的叶片，采用CTAB法提取基因组DNA［4］。用1%琼脂糖凝胶电泳检测质量，用紫外分光光度计检测浓度，最后稀释标定到10ng/μl备用。　　1.3.2ISSR分析从55个引物中筛选出14个扩增谱带清晰且呈多态性的引物用于石斛材料的扩增（见表2）。PCR反应在PTC-200型梯度热循环仪（M

7、JResearch）上进行，ISSR-PCR扩增反应条件经过比较和优化确定为25μl的PCR反应体系，其中包括20mmol/lKCl，10mmol/LTris-HCl(pH9.0)，1.5mmol/LMgCl2，100μmol/LdNTP，20ng基因组DNA，2UTaq聚合酶和0.1μmol/L引物。PCR扩增程序为94℃预变性7min；94℃变性45s，50℃复性45s，72℃延伸2min，循环40次，72℃延伸10min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，用200DNAladder作为分子质量标记，用Alpha2200凝胶成像系统观察结

8、果并拍照记录。　　表2ISSR引物的多态性（略）　　1.3.3数据处理每个样品的扩增带按有或无记录，“有”赋值为1，“无”赋值为0。利用POPGENE32软件计算I