人血小板冻干前负载海藻糖技术的研究

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1、人血小板冻干前负载海藻糖技术的研究作者：卢发强，刘景汉，欧阳锡林，李锡金，周俊，庄远【摘要】为研究人血小板冻干前负载海藻糖技术与方法，筛选出最佳负载海藻糖实验条件并进一步研究血小板在温度37℃条件下、负载海藻糖4小时后的平均体积、体外激活程度和聚集反应性的变化，绘制血小板胞内海藻糖负载效率及浓度随温度、时间、胞外海藻糖浓度变化曲线，筛选合适的负载条件，分别以凝血酶、ADP、胶原、瑞斯托霉素4种物质作为血小板激活诱导剂，用血小板聚集仪分别检测血小板负载海藻糖前后的聚集反应性，用流式细胞仪检测分析血小板负载海藻糖前后其膜表面

2、糖蛋白分子CD62p、PAC-1的表达率，加可逆性激活抑制剂PGE-1、腺苷后血小板激活被抑制的程度。结果表明：海藻糖负载效率与孵育时间（2小时后）、温度（30-40℃）呈良好线性关系，在37℃条件下经4小时孵育后负载效率可达60%，载入到胞内海藻糖浓度随胞外海藻糖浓度（＜50mmol/L﹚的升高而递增；同负载前相比较，血小板平均体积（MPV）、血小板对4种激活诱导剂的最大聚集率均无显著性差别（P>0.01），经4小时负载海藻糖后血小板膜表面CD62p表达率升高，但联合添加可逆性激活抑制剂PGE-1、腺苷后CD62

3、p表达率显著下降。结论：37℃、4小时、胞外海藻糖浓度小于50mmol/L为合适负载条件，添加可逆性血小板激活抑制剂后，冻干前负载海藻糖过程对血小板的体外激活和聚集活性没有显著影响。【关键词】海藻糖　　ProcessofHumanPlateletsLoadedofthisresearchethodsofloadinglyoprotectant-trehaloseintocytoplasmofhumanplateletsbeforelyophilization，tooptimizeexperimentalcondition

4、sofloadingtrehalose，toinvestigatethechangesofplateletsresponsetoagonistsandactivationafterincubationofplateletsfor4hoursat37℃inthepresenceoflyoprotectant-trehalose，toprotractthefiguresofloadingefficiencyandintracellulartrehaloseconcentrationversusincubationtime，t

5、emperatureandexternaltrehaloseconcentration，tooptimizeloadingparameters.Theresponseofplateletstodifferentagonists—thrombin，ADP，collagenandristocetineasuredrespectivelybyAPACT2aggregometerbeforeandafterloadingtrehaloseintoplatelets；theexpressionsofCD62pandPAC-1onp

6、lateletmembranesinthepresenceandabsenceofreversibleplateletsactivationinhibitorseasuredbyfloetryrespectivelybeforeandafterloadingtrehaloseintocytoplasmofplatelets.Theresultsshoe(2hourslater)andincubationtemperature(rangfrom30℃to40℃)，respectively.Theloadingefficie

7、ncyalmostreached60%mol/L﹚.paredtountreatedgroups，thevaluesofMPVandaggregationtodifferentagonistsintreatedgroupsshoeextent，homol/Laretheoptimalconditionsforloadingmol/LNaCl、10mmol/LKCl、10mmol/LEGTA、10mmol/L咪唑、10μmol/l前列腺素-E1，pH6.8)、80%甲醇溶液、硫酸蒽酮试剂、4种血小板聚集反应诱导剂：凝血酶、

8、ADP、胶原、瑞斯托霉素，荧光标记抗血小板表面糖蛋白单克隆抗体（2-8℃保存）：CD62p-PE、CD61-Percp、PAC-1-FITC、RGDS(PAC－1阻断剂)，含1%多聚甲醛及0.1%叠氮钠的PBS（pH7.2）固定液，可逆性血小板激活抑制剂PGE-1和腺苷（Sigma公司产品）。酶标仪、恒温水浴箱、抽真