青天葵组培物超低温保存研究

《青天葵组培物超低温保存研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、青天葵组培物超低温保存研究【摘要】　　目的用超低温方法保存青天葵组培物。方法采用单因子比较法、均匀设计法考察生长周龄、冷冻保护剂、预培养时间、降温方式、化冻方式等因素对青天葵组培物超低温保存后细胞生活力的影响。结果青天葵组培物较佳的超低温保存程序为：５周龄的组培物，在４℃进行低温锻炼１２ｄ，以１２．５％ＤＭＳＯ＋０．２５％ＬＨ为冷冻保护剂，在４℃静置处理３０ｍｉｎ，然后在－１８℃，停留１ｈ后投入液氮中保存，材料取出后，在２０℃化冻，无菌洗涤后，再接种，组培物能够存活并继续生长。结论超低温保存方式可以成功保存青天葵组培物种质资源。【关键词】

2、青天葵组培物超低温保存　　Abstract：ObjectiveＴｏｐｒｅｓｅｒｖｅtheｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅｓｏｆNerviliafordiiｕｓｉｎｇｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ．MethodsＳｕｉｔａｂｌｅｆａｃｔｏｒｓｉｎｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ（－１９６℃）ｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄｂｙｍｏｎｏｆａｃｔｏｒｉａｌａｎｄｕｎｉｆｏｒｍｄｅｓｉｇｎ.ResultsＴｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｆｉｖｅ－ｗｅｅｋｅｄｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅｓｗｅｒｅｔｈｅｂｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｆｏｒｃｒ

3、ｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ．Ｔｉｓｓｕｅｃｕｌｕｒｅｓｔｒｅａｔｅｄｆｏｒ１２ｄａｙｓａｔ４℃ｗｅｒｅｔｈｅｂｅｓｔｃｒｙｏｔｏｌｅｒａｎｔ．Ｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｃｙｒｏｐｒｅｃｔａｎｔｓｗａｓ１２．５％ＤＭＳＯ＋０．２５％ＬＨ．Ｔｈｅｂｅｓｔｆｒｅｅｚｉｎｇｐｒｏｃｅｄｕｒｅｗａｓｔｏｒｅｄｕｃｅｔｈｅｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｆｒｏｍ０℃ｔｏ－１８℃，ａｎｄｓｔａｙａｔｔｈａｔｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｆｏｒ１ｈ，ｔｈｅｎｄｒｏｐｔｈｅｍｉｎｌｉｑｕｉｄｎｉｔｒｏｇｅｎ（－１９６℃）ｔｏｂｅｐｒｅｓｅｒｖｅｄ．２０℃ｗａｓｇｏｏｄｆｏｒｍｅ

4、ｌｔｉｎｇｔｈｅｆｒｏｚｅｎｍａｔｅｒｉａｌ．Ｕｎｆｒｏｚｅｎｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅｓｓｕｒｖｉｖｅｄｗｈｅｎｔｈｅｙｗｅｒｅｒｅｃｕlｔｕｒｅｄ．ConclusionＴｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅｓｏｆNerviliafordiiｃａｎｂｅｐｒｅｓｅｒｖｅｄｂｙｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ．　　Key.　　２　结果分析　　２．１组培物生长周龄对超低温保存后细胞生活力的影响细胞抗冻能力的提高与其分裂和生长活动等生理状态密切相关。取转移到新鲜培养基上的组培物，考察不同的生长周龄（１，２，３，４，５，６，７周）对组培物经超低温

5、保存后的细胞生活力。结果见图１。　　图1组培物生长周龄对冷冻后细胞生活力的影响（略）　　　图2预培养时间对超低温保存后细胞生活力的影响（略）　　由图１知，将组培物转移至新鲜培养基上，开始１周，冷冻后细胞的ＴＴＣ值较低，说明细胞的抗冻能力弱，培养至第２周时，ＴＴＣ值迅速升高，细胞抗冻能力显著增强，第５周的ＴＴＣ值最高，此时细胞的抗冻能力最强，此后，随着培养周龄的增加，ＴＴＣ值呈下降趋势，细胞抗冻能力逐渐减弱。因此选择５周龄的组培物作为超低温保存的材料是适宜的。　　２．２冷冻保护剂对超低温保存后细胞生活力的影响结果见表１～２。　　表1U12（

6、12）12均匀设计因子水平（略）　　按表１均匀设计搭配，组合成１２种方案进行试验，结果见表２。　　表2U12（12）12均匀设计实验安排及结果（略）　　数据经逐步回归处理，得到方程Y＝０．３６９＋０．００４X１２＋４．４９５X６２，R＝０．９０７＞０．９，F＝２０．９２５＞F（７，４）＝１４．６８，方程有显著性意义。由方程知，Ｘ１２和Ｘ２２对Ｙ值有显著影响，均与Ｙ值呈正相关。对方程优化得X１＝１２．５，X６＝０．２５，将其代入方程，得到优化值１．２７５，按公式Y＝＾Ｙ±Uα·Ｓ。当α＝０．１０，Uα＝１．６４４８，计算优化值区间估计为Y＝

7、１．２７５±１．６４４８×０．１２，即１．０７８～１．４７２。按照优化条件进行试验，得到TTC值为１．２８１，在Y值区域内，且比１２次均匀试验Y值都高，说明所得结果是正确的，因此认为１２．５％ＤＭＳＯ＋０．２５％ＬＨ是青天葵组织培养物较佳的冷冻保护剂。　　２．３组培物预培养时间对超低温保存后细胞生活力的影响结果见图２。图２表明，未经预培养的组培物，细胞TTC值最低，抗冻能力较弱，预培养３ｄ后，TTC值开始上升，细胞抗冻能力逐渐增强，到１２ｄ时TTC值达最大，此时细胞抗冻能力最强，此后延长预培养时间，TTC值呈下降趋势，因此试验材料应在４℃

8、预培养１２ｄ后再进行超低温保存。　　２．４降温方式对超低温保存后细胞生活力的影响实验比较快冻法（从０℃直接投入液氮中保存）和两步冷冻法的冷冻效果，着重考察两步法中在－１８℃停留不同时间（０．５