柳叶洗眼液的制备及猴肾传代细胞中抗ev70病毒的实验研究

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1、柳叶洗眼液的制备及猴肾传代细胞中抗EV70病毒的实验研究作者：刘卫，刘景东，庄甲举，张如春，马钢【关键词】柳叶；,,洗眼液；,,EV70病毒　　摘要：目的研究柳叶洗眼液并观察疗效，探讨柳叶洗眼液抗EV70病毒的作用。方法采用水提、醇沉、超滤、灭菌等方法从新鲜柳叶制备洗眼液；使用不同浓度的洗眼液对感染EV70的单层培养MEK细胞进行处理以观察其抗病毒效应。结果柳叶洗眼液对MEK细胞的最大无毒浓度为1/4药浓度。在病毒感染的同时给予柳叶洗眼液可明显抑制病毒的增殖。结论柳叶洗眼液具有明显的抗EV70的作用。　　关键词：柳叶；洗眼液；EV70病毒　　PreparationofEK

2、cellsentofeyeultaneouslyEV70infection.ConclusionEK）传代细胞作为检测系统，观察该药物的体外抗病毒效果。　　1材料与方法　　1.1材料UV265型紫外-可见分光光度计（日本岛津）；柳叶Salixbabylonica.L.（秋天现采现用或采集后低温放置）；邻苯二酚（优级纯含量99.9%）；其它试剂均为分析纯。　　1.2方法　　1.2.1柳叶洗眼液的制备　　1.2.1.1处方柳叶200g，焦亚硫酸钠1g，乙二胺四乙酸二钠0.3g，总量1000ml。　　1.2.1.2制备方法取柳叶200g，用常水洗后，再用蒸馏水洗，置玻璃烧瓶中，

3、加水500ml，加热提取1h，滤出液体，药渣再加水500ml，提取1h，滤出液体，合并两次滤液。浓缩至500ml，加95%乙醇1000ml，搅动匀，静置24h，过滤，减压回收乙醇，至无醇味，加蒸馏水950ml，焦亚硫酸钠1g，乙二胺四乙酸二钠0.3g，搅匀，用0.1mol・L-1盐酸调pH6~7，用0.3μm滤膜抽滤，最后定容至1000ml，灌封于100ml玻璃瓶中，100℃流通蒸汽灭菌30min。　　1.2.2质量标准　　1.2.2.1性状本品为淡黄色透明液体。　　1.2.2.2鉴别取柳叶洗眼液50ml，置分液漏斗，加入乙醚50ml，萃取3次，弃去水层，合

4、并醚层，水浴回收乙醚，残渣用乙醇定容至5ml。另取邻苯二酚制成每2g・L-1甲醇溶液，作为对照品。照薄层色谱法试验［1］，吸取教训上述两种溶液各2～10μl。分别点于同一硅胶G薄层板上，以丙酮-25%氨水（99∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，于碘蒸气中放置1min，在与对照品相应的位置上，供试品色谱分别显相同的红棕色斑点。　　1.2.2.3含量测定标准曲线的绘制：精密吸取邻苯二酚标准溶液（精密称取干燥至恒重的邻苯二酚10mg,加95%乙醇5ml溶解，加1mol・L-1盐酸5ml，用水定容至5ml）0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2

5、ml量瓶中，分别加入1mol・L-1盐酸2.4ml，显色剂1ml（亚硝酸钠10g，钼酸钠15g，加水溶解，定容至100ml），1mol・L-1氢氧化钠5ml，用水定容至刻度，放置30min，以水为空白，在波长（500±1）nm处测定吸收度。结果表明，邻苯二酚在1.5～9.0μg・ml-1范围呈良好的线性关系，其回归方程为：A=0.0817C+0.0381，Y=0.9996。含量测定：精密吸取柳叶洗眼液50ml，置分液漏斗，加入乙醚50ml，萃取3次，弃去水层，合并醚层，水浴回收乙醚，残渣用水定容至5ml。精取1ml，按标准曲线绘制

6、方法测定吸度并计算含量。回收率实验：采用加样回收法，取已测含量的柳叶洗眼液适量，分别添加邻苯二酚，按柳叶的测定计算回收率，平均回收率为96.1%。RSD2.54%。　　1.2.3抗肠道EV70病毒的实验　　1.2.3.1细胞单层培养MEK传代细胞（由军事医学科学院五所微检中心细胞库提供），生长液1640含10%小牛血清，维持液1640含2%小牛血清，在37℃、5%CO2培养箱中，细胞培养24h。　　1.2.3.2病毒EV70毒株名：AHC/J670/71（购自昆明医学生物所）。实验用病毒均为我实验室用MEK细胞传代第2代。　　1.2.3.3病毒感染及TCID50/ml滴定

7、病毒感染及滴定在25×50mm方瓶中、单层MEK细胞上进行，以细胞病变（cytopathiceffect,CPE）作为病毒感染指标，每瓶细胞加不同稀释度病毒2ml，每个稀释度接种4瓶细胞，室温吸附1.5h后，弃去病毒液，加入维持液，33℃孵育，逐日观察CPE出现情况，滴度按Behrens-Kaerber方法计算，以TCID50/ml表示。　　1.2.3.4柳叶提取液对MEK细胞的毒性实验采用柳叶提取原液、柳叶提取原液1/2浓度、柳叶提取原液1/4浓度3种浓度，分别加入到细胞中，在28℃不同时间，观察对细胞生长的影响。　　1.2