柳叶洗眼液的制备及猴肾传代细胞中抗ev70病毒的实验研究论文

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1、柳叶洗眼液的制备及猴肾传代细胞中抗EV70病毒的实验研究论文刘卫，刘景东，庄甲举，张如春，马钢【关键词】柳叶；,,洗眼液；,,EV70病毒摘要：目的研究柳叶洗眼液并观察疗效，探讨柳叶洗眼液抗EV70病毒的作用。方法采用水提、醇沉、超滤、灭菌等方法从新鲜柳叶制备洗眼液；使用不同浓度的洗眼液对感染EV70的单层培养MEK细胞进行处理以观察其抗病毒效应。结果柳叶洗眼液对MEK细胞的最大无毒浓度为1/4药浓度。在病毒感染的同时给予柳叶洗眼液可明显抑制病毒的增殖。结论柳叶洗眼液具有明显的抗EV70的作用。关键词：柳叶；洗眼液；EV70病毒PreparationofEKcellsentofeyeulta

2、neouslyEV70infection.ConclusionEK传代细胞（由军事医学科学院五所微检中心细胞库提供），生长液1640含10%小牛血清，维持液1640含2%小牛血清，在37℃、5%CO2培养箱中，细胞培养24h。1.2.3.2病毒EV70毒株名：AHC/J670/71（购自昆明医学生物所）。实验用病毒均为我实验室用MEK细胞传代第2代。1.2.3.3病毒感染及TCID50/ml滴定病毒感染及滴定在25×50mm方瓶中、单层MEK细胞上进行，以细胞病变（cytopathiceffect,CPE）作为病毒感染指标，每瓶细胞加不同稀释度病毒2ml，每个稀释度接种4瓶细胞，室温吸附1.

3、5h后，弃去病毒液，加入维持液，33℃孵育，逐日观察CPE出现情况，滴度按Behrens-Kaerber方法计算，以TCID50/ml表示。1.2.3.4柳叶提取液对MEK细胞的毒性实验采用柳叶提取原液、柳叶提取原液1/2浓度、柳叶提取原液1/4浓度3种浓度，分别加入到细胞中，在28℃不同时间，观察对细胞生长的影响。1.2.3.5柳叶提液抗EV70作用为了确定柳叶提取液的抗病毒作用，采用病毒感染细胞的前60min给药，感染细胞90min后给药，病毒与药物同时加入到细胞中等不同的途径给药进行观察，观察细胞出现CPE的情况。2结果2.1EV70（AHC/J670/71）TCID50滴定经实验计算

4、，该毒株LgTID50/ml为7.76；图中A~D显示EV70在MEK单层细胞中繁殖生长，产生CPE情况。见图1。a正常细胞对照，b~d分别为毒株感染（10-5）24、48、72h细胞出现CPE情况图1EV70（AHC/J670/71）在MEK单层细胞中繁殖产生CPE情况（略）2.2柳叶提取液对MEK细胞的毒性表1显示MEK细胞在3种不同浓度柳叶提取液作用下，不同时间的细胞生长情况。结果表明：原浓度在细胞中作用60min内，细胞无明显损伤。当原药浓度在细胞中作用90min，80%以上细胞的生长形态发生不可逆改变，细胞变圆、肿大、折光性增加、最后裂解。柳叶提取液对MEK细胞的最大无毒浓度为1/

5、4原药浓度。见图2。a正常对照；b、c药物作用30，60min图2柳叶药物原液对MEK细胞生长的影响（略）表1不同浓度药物对MEK细胞生长的影响（略）―为无损伤+为无明显损伤++为不可逆改变的损伤2.3柳叶提取液的抗EV70作用实验中我们采用了EV70感染细胞的同时给药，攻击病毒量为100TCID50，给药物组细胞出现细胞病变的时间比无药对照组后延48～24h，结果表明，在感染的同时用药，显示了对EV70的明显抑制作用，与对照组比较，用药组出现CPE的时间后延（当接种病毒量为1000TCID50/ml时，CPE出现延时12～24h），CPE程度明显减弱，细胞存活率提高，通过活细胞计数发现，当

6、无药对照组100%细胞出现CPE时，药物组产生CPE的细胞不到30%。见图3。a、b为加药组；c、d为无药对照；b、d为a、c的4倍放大照片图3药物+EV7010-5在试管内作用于1h后，加入到细胞吸附1.5h后，换维持液33℃孵育52h时的结果（略）2.4柳叶病毒作用效果观察固定柳叶提取原液浓度，观察不同浓度病毒抑制作用，结果表明，病毒攻击量低于或等于1000TCID50时，在48h时，滴定柳叶提液组的病毒滴度比无柳叶提取液对照组降低了1.5～1.0个对数单位，同时观察到，病毒稀释度愈高，柳叶液的抑制效果愈强，其细胞CPE程度弱，时间后延48～24h，活细胞百分离增大。3讨论柳叶主要含有水

7、杨苷、碘、邻苯二酚、鞣质［1，2］等物质，其生理活性为协同作用，通过实验建立柳叶中邻苯二酚定性、定量的方法，仅作为柳叶或制剂质量标准的一项指标。制止病毒吸附，干扰病毒侵害细胞，是寻找抗病毒药物的一种途径［4，5］。实验结果表明，柳叶提取液对EV70有明显抑制作用［3］，在阻实验条件下细胞无毒性。在本实验中，当病毒感染细胞的同时加药，表现出较好的抑制效果。当药物浓度不变时，随着病毒感染剂量的减少，药物的抑制作用