免疫磁珠法分离和提纯雪旺细胞的实验研究

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1、免疫磁珠法分离和提纯雪旺细胞的实验研究作者：黄明罗卓荆肖伟张强【摘要】［目的］探讨利用免疫磁珠从SD大鼠坐骨神经分离培养获得大量、高纯度雪旺细胞的方法。［方法］选用4～7dSD大鼠，无菌条件下取双侧坐骨神经，解剖镜下剥离去除神经外膜，获得神经束，将神经束剪碎至1mm3大小。采用双酶2次消化法消化，胎牛血清中止消化后，离心并加入DF12培养液培养。7d后应用免疫磁珠法对细胞进行纯化培养，培养2d后进行传代接种。培养过程中对细胞进行形态学观察、计数及活力测定；MTT法绘制细胞生长曲线，采用免疫细胞化学荧光染色对细胞进行鉴定并且计算所得细胞纯

2、度。［结果］分离培养所得细胞即为雪旺细胞；采用免疫磁珠法能对培养所得雪旺细胞进行纯化。纯化后雪旺细胞活力为96%±0.5％，纯度98%±1.1%，培养2d后就可以传代。［结论］免疫磁珠法可以用于雪旺细胞的纯化培养，所得雪旺细胞纯度高，活力强，能满足组织工程人工神经的需要。【关键词】雪旺细胞；免疫磁珠；坐骨神经Abstract：［Objective］TointroduceamethodtoobtainSchneassivelyandpurelybyimmunomagicheadsmethod.［Method］SDratsthathadbe

3、enbornicroscopethenervefasciclesandtheepineuriumpuritycell.Thenthenervetractallparticleabout1mm3.Tes(0.25%trypsinaseand0.2%collagenaseⅠ)ensttostoptheprocessofdigestion,centrifugate(1000r/min,5min)andDF12culturemediummunomagicheads.DuringtheicroscopandvitalforceofSchmunof

4、luorescenttestandrecordthepurity.［Result］ThecellseparatedfromtheSDrat'ssciaticnerveandculturedinincubatoredasSchmunomagicheadscanbeusedtopurifytheSchethodcanobtainmassivepurifiednormalschmunomagicheads;sciaticnerve雪旺细胞（Schaagiccellsorting，德诺DYNA公司)，细胞磁性分离器（德诺DYNA公司）。Mous

5、eAntip75LNGFr（武汉博士德）。SABC免疫组化试剂盒（武汉博士德）。MTT（Gibco）。DMSO(Gibco)。消化用酶0.25％的胰蛋白酶（Sigma）和0.2％的Ⅰ型胶原酶（Gibco）。仪器倒置相差显微镜（NIKON,TE2000E）,解剖镜，酶联免疫检测仪（蒙雷，芬兰）。1.2细胞分离脱颈法处死仔鼠，75％酒精浸泡消毒10min，Dhanks′液冲洗。切开股骨干后外侧皮肤，更换器械后，取双侧坐骨神经（长约1cm），置于已加入Dhanks′液的培养皿中。16倍解剖镜下剥除神经外膜，分离得到神经束。Dhank

6、s′液漂洗3次，每次0.5min。剪成1mm3左右的碎块，用吸管将其移至离心管中。加入0.25％的胰蛋白酶和1ml0.2％的Ⅰ型胶原酶,37℃混合消化约30～40min，吸弃上清液，再加入0.2％的Ⅰ型胶原酶4ml，37℃消化约50～60min，消化过程中每隔20min振荡消化液一次以利于消化。消化结束后，利用火焰抛光的玻璃吸管小心进行机械吹打，直至溶液呈混悬状，无明显肉眼可见组织。1000r/min离心5min，吸弃上清并加入DF12培养液4ml（含体积分数为20％胎牛血清）终止消化，再次1000r/min离心5min，吸弃上清，加入

7、DF12培养液4ml(含体积分数为20％的胎牛血清)吹打混匀，计数后将浓度为2×105/ml的细胞悬液接种于塑料细胞培养瓶，置体积分数为5％的CO2孵箱中37℃培养。培养过程中每24h观察细胞形态及生长情况。1.3细胞纯化细胞接种后第7～10d，吸弃培养液，加入0.25％的胰蛋白酶消化，制成细胞悬液4ml，而后加入MouseAntip75LNGFr100μl，37℃培养，10min后加入200μl免疫磁珠（标记羊抗鼠IgG），37℃培养15min后，置于磁性分离器上，吸去上清，加入DF12培养液5ml(含体积分数为20％的胎牛血清)，

8、5％CO237℃培养24h后,再置于磁性分离器上，分析上清。目的细胞在上清液中，移至培养瓶中继续培养，倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。培养2d后即可进行传代。吸弃培养液，PBS液清洗1次，0.25％的胰蛋