免疫印迹技术分析树舌多糖gf对h22肝癌移植瘤pten蛋白表达的影响

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1、免疫印迹技术分析树舌多糖GF对H22肝癌移植瘤PTEN蛋白表达的影响【摘要】目的探明树舌多糖（GAPS）GF对H22肝癌移植瘤PTEN蛋白表达的影响。方法昆明种小鼠随机分为两组：肿瘤组和树舌多糖组，接种后各组肌肉注射给药，分别给与生理盐水和树舌多糖GF。连续10d，于末次给药24h，处死小鼠，剥离肿瘤组织。ethodsMiceofKunmingstrainlyintotorgroupandGAPSgroup.AllthemiceaH22,thenalsalineandGAPSGFrespectivelyfor10days.Afterthelasttimeofinjectio

2、n,allthemiceortissueandobservedtheexpressionofPTENprotEInbyorgrouporactiontargetofGAPSGFmaybetheantioncogenePTEN.　　KeyorofhepatomaH22；PTENproteins　　树舌Ganodermalipsiense，又称“老牛肝”“扁芝”或“扁木灵芝”，是一种大型担子菌，其性平，味微苦，临床多用于治疗乙型肝炎、食道癌、神经衰弱和肺结核等病症。树舌多糖GF是从树舌中提取的一个组分，有明显抗肿瘤的作用，能显著抑制H22肝癌移植瘤p53基因［1］，N-Ras基

3、因［2］的表达和提高p16［3］，Rb［4］的表达量。本研究采用a公司产品；琼脂糖等试剂为国产分析纯。　　1.2设备XL100K低温离心机，DYZ28A型垂直板电泳槽，DYY11型电泳仪，恒温摇床，75℃冰箱，Mettler电子天平，Millipore超纯水机，UV1700紫外可见分光光度计，转印仪等。　　1.3方法　　1.3.1造模与给药雌雄各半的昆明种小鼠20只，，随机分为2组，每组10只：分别为肿瘤组和树舌多糖组。选择7～10d生长良好的瘤株，无菌取腹水，用生理盐水1∶3稀释至2.0×106个/ml，0.2%台盼蓝染色，计活细胞数大于95%，以0.2ml/只

4、接种于小鼠右侧腋窝下。接种6h后，各组肌肉注射给药0.1ml/只。树舌多糖组按50mg/kg/d给药，肿瘤组小鼠给与生理盐水，连续10d。　　1.3.2可溶性蛋白的提取于末次给药24h，处死小鼠，剥离肿瘤组织，置于冰冷的研钵中，加适量液氮研磨。然后置于3倍体积细胞裂解液中，用玻璃匀浆器进行匀浆。在匀浆液中加入20μg/mlDNaseⅠ和5μg/mlRNaseA，4℃作用15min，再振荡混匀5min，然后4℃，25000g离心45min，小心避开表面的脂质层取上清液，即为蛋白提取物。loA。电泳后进行NC膜转移，在冷却条件下100V电转4h。将NC膜浸泡于3%BSA/TBS

5、溶液中，4℃封闭过夜。洗膜后加入兔抗小鼠PTEN多克隆抗体（1∶100稀释），室温孵育2h。再次洗膜后加入过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体，室温孵育0.5h。洗膜后加入DAB染液，至蛋白条带清晰可见时，把NC膜迅速放入超纯水中终止反应。用吸水纸吸干NC膜上的水分后，用扫描仪进行扫描，保存实验结果。　　2结果　　RNA的水平，可以影响其分泌，从而调控血管生长［10］，进而影响肿瘤的生长和转移。PTENcDNA的5＇端的非翻译区中有多个CGC重复序列，为甲基化提供了调节可能。高甲基化使PTEN基因处于静止态,造成PTEN的低水平转录或PTEN蛋白的缺失［11］，从而消除了PTE

6、N对一些肿瘤细胞系生长的抑制能力。本研究orsuppression：PTENsuppressestumorformationbyrestrainingthephosphoinositide3-kinase/AKTpathodulatedtheexpressionofalpha5beta1integrinandintegrin-mediatedsignalinginhumanhepatocarcinomacells［J］.BiochemBiophysResmun，2000，274：519.　　［7］RomashkovaJA，MakarovSS．NF2JBisatargetof

7、AKTinanti-apoptoticPDGFsignaling［J］.Nature，1999，401（6748）：86.　　［8］erFI，ParentCA．PI32kinasesandPTEN:hooattract［J］.Cell,2002，109（5）：541.　　［9］BackmanS，StambolicV，MakT．PTENfunctioninmammaliancellsizeregulation［J］.CurrOpinNeurobiol，2002，12（5）：516.　　［10］KoulD，ShenR，