石菖蒲抑酶活性的实验研究

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1、石菖蒲抑酶活性的实验研究【摘要】目的建立体外抑制乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AchE)活性实验方法，探讨石菖蒲抑酶活性及活性部位。方法提取制备石菖蒲根和叶的乙醚、醋酸乙酯及正丁醇萃提液，以石油醚-醋酸乙酯(85∶15)为展开剂，对石菖蒲根和叶的乙醚萃提液层析分离后进行抑制AChE活性试验，采用分光光度法分别测定石菖蒲根和叶醋酸乙酯及正丁醇萃提液的AChE抑制率。结果石菖蒲根和叶的挥发油在薄层板显示有显著抑酶斑点，石菖蒲根和叶的乙醚萃提液薄层色谱中与α-细辛醚和细辛醚对应的显著抑酶斑点比移值为Rf0和Rf(0.64±0.01)[t=(17±2)℃];石菖

2、蒲根和叶的醋酸乙酯及正丁醇萃提液酶抑制率分别为39.17%，18.45%，24.33%和1.74%;石菖蒲根的水溶液无明显抑酶斑点但测定仍有较弱酶抑制率，石菖蒲叶的水溶液无抑酶斑点且两者均显示蓝色斑点。结论石菖蒲根和叶的挥发油具较强抑制AChE活性，其中α-细辛醚为强抑酶活性成分，石菖蒲根醋酸乙酯和正丁醇萃提液抑酶活性分别较石菖蒲叶强，石菖蒲根水溶液有微弱抑酶活性而叶的水溶液无抑酶活性，但两者的水溶液均有酶促作用的成分。该法作为一种体外抑酶(AchE)活性实验，结果与　　2.5薄层分离抑酶实验　　2.5.1薄层层析取2块硅胶G-CMC板，平行操作，分别吸取样品液①和②各10μl,

3、α-细辛醚和细辛醚对照液各5μl，点于同一硅胶G-CMC板,其中1块点石菖蒲药材液，置层析缸中,以石油醚-醋酸乙酯(8.5∶1.5)为展开剂，饱和10min后上行展开,完毕，取出自然挥干溶剂，不点石菖蒲药材液的板喷5%的香草醛硫酸溶液显色。结果见色谱图1。其中样品与α-细辛醚对照品在Rf0和Rf(0.65±0.02)斑点一致，样品与细辛醚在Rf0和Rf(0.65±0.05)斑点一致。　　2.5.2酶抑制实验取上述薄层层析后未显色层析板，按酶抑制法[8]试验。结果见图2。其中样品与对照品在Rf0、Rf(0.65±0.02)和Rf(0.65±0.05)有对应抑酶斑点。　　图1薄层色谱

4、图(t=17±2℃)图2抑酶色谱图　　2.6酶抑制率测定　　2.6.1吸收曲线取“2.1”项酶试液加去离子水(-4℃冷藏)稀释(1→10ml),精密吸取稀释酶试液1ml于试管，置37℃的恒温水浴中放置20min，取出立即加入底质溶液2ml，振摇均匀，以去离子水为空白，作吸收度扫描。结果见图3。在λ(540±1)nm波长处有最大吸收。　　图3AchE反应生成物吸收曲线　　2.6.2酶抑制率测定按“2.4”项操作，将石菖蒲根和叶依次以乙醚、醋酸乙酯和正丁醇萃取后溶液作为样品I，II，III，IV，V，VI。分别取样品1.0ml于试管，各精密加入稀释酶试液1ml，置37℃的恒温水浴中放

5、置20min，取出立即加入底质溶液2ml，取离子水1.0ml精密加入稀释酶试液1ml平行操作为对照，去离子水为空白，在λ(540±1)nm处分别测定吸收度，按公式：酶抑制率(%)=(对照管吸收度-样品吸收度)/对照管吸收度×100%计算。结果见表1。表1酶抑制率测定结果　　3讨论　　实验采用薄层抑酶定性及比色法定量的方法，对石菖蒲根和叶进行了体外抑酶活性成分筛选及活性部位酶抑制测定。定性及定量实验结果均表明石菖蒲具有抑制乙酰胆碱酯酶作用，该结论与石菖蒲不同提取部位降低乙酰胆碱酯酶活力[9]的体内实验报道一致，说明了该方法作为一种体外抑制乙酰胆碱酯酶(AChE)活性筛选试验的可行性

6、和准确性。　　薄层实验结果显示石菖蒲根分离出的色谱斑点较其叶多，其中除α-细辛醚抑酶斑点外，还有另外两个抑酶斑点，表明石菖蒲根和叶化学成分的差异，此外α-细辛醚与细辛醚在薄层色谱和抑酶斑点的Rf值均有差异，可根据β-细辛醚和γ-细辛醚对照品进一步确定样品对应斑点的化学成分，同时石菖蒲除挥发油中已知成分达三十个以上，还有多种水溶性及其它成分[10]。因此该实验中石菖蒲其他活性部位的化学结构类型以及根和叶水溶性部分增色现象缘何物质，均需通过多种分析方法作出判定。　　实验结果显示石菖蒲根各提取部位抑酶活性均较叶强，表明其根活性成分较叶高，与根入药的传统用法相符，且酶抑制率测定结果表明石

7、菖蒲根经正丁醇萃取后的水溶液仍有微弱的抑酶活性，即石菖蒲根水溶性部分有抑酶活性成分，定量测定结果与前期定性筛选实验相吻合[7]。　　实验表明石菖蒲中挥发油和细辛醚有较强抑制乙酰胆碱酯酶活性，由此推测石菖蒲能提高乙酰胆碱神经递质的水平，这是否成为石菖蒲治疗老年记忆减退和益智作用的又一机理，还有待进一步实验证明。【参考