强精煎抑制实验小鼠睾丸生精细胞凋亡的机制研究

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1、强精煎抑制实验小鼠睾丸生精细胞凋亡的机制研究作者：宾彬王杰陈定雄莫秋柏徐杰新崔锦珠【摘要】目的观察强精煎对实验小鼠睾丸Fas和Fasl蛋白表达的影响，探讨其抑制生精细胞凋亡的机制。方法将80只健康雄性昆明种小鼠分为正常组、模型组，强精煎组、黄精赞育胶囊组，除正常组用生理盐水外其他各组均以环磷酰胺注射液40mg/kg腹腔注射造模，造模成功后，正常组及模型组分别给予蒸馏水，后两组分别给予相应药物灌胃治疗30d。第31天处死小鼠，利用H-E染色观察小鼠睾丸病理形态，用免疫组织化学SABC法检测Fas和Fasl蛋白在小鼠睾丸实质组织中的表达。结果与模型组比较，强精煎组和黄精赞育胶

2、囊组睾丸Johnson评分偏高，Fas和Fasl蛋白的表达率偏低(P<0.01);与空白组比较，模型组Johnson评分偏低，Fas和Fasl蛋白表达率偏高(P<0.01);强精煎组和黄精赞育胶囊组差异无统计学意义(P>0.05)。结论强精煎可以下调Fas和Fasl蛋白在受损伤小鼠睾丸实质组织中的表达，这可能是其抑制生精细胞凋亡的分子机制之一。【关键词】强精煎;生精功能障碍;实验研究大量研究表明，生精细胞的过度凋亡是导致生精功能障碍的重要病因，而Fas/Fasl系统在生殖细胞的凋亡中又起着重要作用[1]。我们前期的研究显示，以补肾健脾为主要功效的中药强精

3、煎具有抑制环磷酰胺所致小鼠睾丸生精细胞过度凋亡的作用[2]，而该作用机制是否也与Fas/Fasl系统有关尚不清楚，为此笔者进行了初步探索。　　1材料　　1.1药物强精煎(经验方，主要由菟丝子、枸杞子、益母草、当归、党参、牡蛎组成)，为提高本实验的可重复性，采用单味中药配方颗粒，由江苏省江阴天江药业有限公司生产，批号：0803193，将各单味药物倒入量杯，加入100℃蒸馏水，充分混匀，配成药物浓度为0.335g/ml的混悬液，密封，置4℃冰箱保存备用。黄精赞育胶囊(由何首乌、黄精、菟丝子、枸杞子、五味子、熟地黄等组成)，上海新亚药业邗江有限公司生产，批号：080101。去除

4、胶囊外壳，将胶囊内药物颗粒研磨成粉状，80目过筛后，加入蒸馏水继续研末5min，配成药物浓度为0.0375g/ml的混悬液，密封，置4℃保存备用。　　1.2试剂注射用环磷酰胺(CP)，江苏恒瑞医药股份有限公司生产，生产批号：08012921。以0.9%氯化钠注射液配制成4mg/ml的溶液，现配现用;Bouin液：将冰醋酸、甲醛、苦味酸饱和水溶液按1∶5∶15比例配制，现配现用;即用型Fas、Fasl多克隆抗体及SABC免疫组化染色试剂盒(标记长臂的生物素羊抗兔IgG、亲和素、过氧化物酶)，底物DAB显色试剂盒，PBS缓冲液，均购自武汉博士德生物工程有限公司。　　1.3动物

5、8～9周龄健康雄性昆明种小鼠80只，清洁级，体重(33±2.58)g，由广西医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK桂2003-0003，购回后饲养在广西中医学院动物实验中心，检疫1周，根据体质量采用随机数字表法随机分为4组，即正常组、模型组、黄精赞育胶囊组和强精煎，每组20只。　　2方法　　2.1造模及给药方法采用环磷酰胺致小鼠生精功能障碍模型，方法参考陈守真法[3]，除正常组给予等剂量生理盐水外，其余各组以环磷酰胺每天按40mg/kg体重进行腹腔注射，1次/d，连续5d。造模结束后第1天即给予药物治疗。对照组及治疗组分别灌胃黄精赞育胶囊混悬液或强精煎混悬液0.4m

6、l/d(按体质量30g的小鼠体表面积折算均相当于体质量60kg的成人用量)，正常组和模型组均以等量蒸馏水代替，1次/d，连续30d。第31天用颈椎脱臼法处死小鼠，取左侧睾丸，放在Bouin液中固定，24h内取出，用自动脱水机脱水后，用包埋机包埋成蜡块备用。　　2.2睾丸组织病理形态的观察将已经用石蜡包埋的睾丸标本切成厚约4μm的连续石蜡切片，HE染色，光学显微镜下观察其病理形态，采用Johnson评分法[4]评价精子发生和精子发生障碍的程度。生精功能正常为10分;各期生精细胞存在，但排列紊乱为9分;生精小管中有少量精子(5～10个)为8分;无精子，但有许多精子细胞为7分;

7、无精子，仅有少量精子细胞(5～10个)为6分;无精子，但有许多精母细胞为5分;无精子细胞，仅有个别精母细胞(<5个)为4分;仅有精原细胞为3分;无生精细胞，仅有支持细胞的为2分;管腔内无细胞为1分。评分越高精子发生越好，反之，精子发生障碍程度越严重。　　2.3睾丸组织Fas及Fasl蛋白表达情况的检测严格按照博士德公司所提供的免疫组化SABC法操作步骤分别检测Fas和Fasl，用PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照，用已知的阳性组织作为阳性对照。镜检睾丸组织细胞膜或细胞质内出现棕黄色或棕色染色为阳性细胞。在高倍镜下(400×