耳针对拟阿尔茨海默病模型大鼠海马神经原纤维缠结的影响

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1、耳针对拟阿尔茨海默病模型大鼠海马神经原纤维缠结的影响：苗婷潘娅王旭东蒋乃昌【摘要】目的：研究耳针对拟阿尔茨海默病（Alzheimer’sDisease，AD）模型大鼠海马神经原纤维缠结（NFT）的影响。方法：采用冈田酸(OkadaicAcid，OA)海马CA1区微量多次注射建立拟AD大鼠模型，针刺肾、脑耳穴，观察大鼠行为学变化，Bielschoyloidprotein，Aβ)为中心的老年斑(senileplaques，SP)，脑细胞内由高度磷酸化的微管相关蛋白tau蛋白构成的神经原纤维缠结(neurofibrillarytangles，NFT)，胆碱能神经纤维功能退化[2]。目前AD

2、的病因及发病机制尚未完全明了，治疗上也没有特别有效的药物。祖国医学认为肾虚精亏、浊毒痹阻脑络可能是其主要的病理基础，而针灸可以补肾填精、健脑益智。为探索AD非药物疗法的新途径，对AD大鼠模型给予耳针治疗，观察大鼠学习记忆及海马CA1区NFT形态和数量的变化，探讨耳针治疗对拟AD模型大鼠的作用及其机理。1材料与方法1.1动物和分组3～5月龄SD雄性大鼠30只，体重220～280g，由贵阳医学院实验动物中心提供[合格证号：SCXK(黔)2002—0001]。随机分为3组：对照组、拟AD模型组、耳针治疗组，每组10只，自然条件下笼养、喂食。1.2试剂和仪器OA购自美国sigma公司；脑立体

3、定位仪DYTI，中国天津生产；Morris水迷宫，上海吉量软件科技有限公司产品；显微镜(带摄像装置及图像分析系统)，德国Leica公司产品。1.3拟AD动物模型的建立大鼠称重，10%水合氯醛麻醉(0.3ml/100g)后，固定于大鼠脑立体定位仪上，参照GeorgePaxinos[3]的大鼠脑立体定位图谱，于前囟后3.6mm，中线右侧旁开2.4mm处垂直插入自行设计的十字形小管，牙科水泥固定。然后通过纵管进行海马CA1区微量注射(深度2.7mm)，拟AD模型组、耳针治疗组缓慢注射0.4mmol/L的OA(用10%的二甲亚砜溶解配制)0.5μl，5min注射完毕，留针10min，隔1d

4、同样剂量注射1次，共5次；对照组同样方法注入等体积的对照液10℅DMSO。术后创面滴庆大霉素，肌肉注射青霉素预防感染。1.4耳针治疗方法　　耳针治疗组于拟AD模型制作同时进行。常规消毒后用无菌针灸针埋入大鼠脑、肾耳穴[4]，每日1次，治疗3周，每日检查耳针是否脱落，若有脱落即补上。1.5观测指标1.5.1水迷宫实验各组大鼠于海马末次注射完的第3周后进行Morris水迷宫定向航行实验和空间探索实验，共7d。第1～6天进行定向航行实验，每天将大鼠按Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限顺序从各入水点面靠池壁放入水中，记录60s内大鼠从入水池到爬上站台所需时间即为潜伏期。每只大鼠每天训练4次，上下午各2次。第

5、7天空间探索实验，撤去站台，将大鼠从第Ⅰ象限入水点放入水池，记录120s内大鼠在第Ⅲ象限的游泳时间和穿越站台的次数。1.5.2灌注取材水迷宫实验结束后，大鼠用10％水合氯醛麻醉，生理盐水和4％中性多聚甲醛灌注后，断头取脑，置4％中性多聚甲醛浸泡固定。取海马注射点前后约3mm厚标本，经脱水、透明、浸蜡及石蜡包埋后，大鼠海马冠状位切片，片厚3μm。1.5.3改进的Bielschoin；福尔马林液还原数秒钟至切片呈现黄色为止；用氨银溶液滴染20～40s，福尔马林液再次还原1～2min，使切片呈棕黄色；用0.2％氯化金溶液调色2～5min；5％硫代硫酸钠水溶液固定3～5min；然后经乙醇脱水

6、，二甲苯透明，中性塑胶封固。1.5.4显微镜观察采用Leica摄像显微镜观察并照像。NFT可在海马形成并在轴突处染色较深呈拖尾状，计数每张切片4个随机高倍视野中神经元NFT样改变数，并取平均值作为计数结果。对照组、拟AD模型组、耳针治疗组的平均逃避潜伏期不断缩短，从第1天开始，拟AD模型组与对照组比较，平均逃避潜伏期明显延长(P<0.01)；耳针治疗组与拟AD模型组比较，平均逃避潜伏期明显缩短(P<0.01)，见表1。空间探索实验结果表明，拟AD模型组与对照组比较，第Ⅲ象限活动时间明显缩短(P<0.01),穿越站台次数明显减少(P<0.01)；耳针治疗组与拟A

7、D模型组比较，第Ⅲ象限活动时间明显延长(P<0.01)，穿越站台次数明显增多(P<0.01)。见表1。表1各实验组大鼠平均逃避潜伏期注：(1)与对照组比较，P<0.01；(2)与拟AD模型组比较，P<0.01。表2各实验组大鼠第Ⅲ象限活动时间和穿越站台次数注：（1）与对照组比较，P<0.01；（2）与拟AD模型组比较，P<0.01。2.2海马CA1区NFTBielschoptommaticdiagnosis，preven