粉防己碱诱导宫颈癌细胞凋亡的定性定量研究

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1、粉防己碱诱导宫颈癌细胞凋亡的定性定量研究：朱克修，李玢，邓卓，袁彩萍，慕建宁，韩晓兵【摘要】目的从定性定量角度探讨粉防己碱诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡的作用。方法采用MTT法检测不同浓度粉防己碱作用不同时间对人宫颈癌HeLa细胞株的增殖抑制作用。通过流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测细胞凋亡情况。结果粉防己碱对宫颈癌HeLa细胞具有增殖抑制作用，且呈时间、浓度依赖性。应用流式细胞仪检测到15μmol/L粉防己碱诱导HeLa细胞产生的凋亡率为(51.8±0.97)%，显著高于对照组凋亡率(24.3±1.23)%(P<0.05)。通过激光共聚焦显

2、微镜观察，与对照组比较，粉防己碱作用后HeLa细胞具有明显的凋亡形态。结论粉防己碱能够抑制HeLa细胞的增殖并诱导其凋亡。【关键词】粉防己碱；宫颈癌；凋亡；ChinaABSTRACT:ObjectiveTostudytheeffectsoftetrandrineonapoptosisofHeLacervicalcancercellsqualitativelyandquantitatively.MethodsTTassay.TherateofHelacellapoptosisinducedbytetrandrineeterandconfocall

3、aserscanningmicroscope(CLSM).ResultsTetrandrineinhibitedtheproliferationofHeLacellsindosage-andtime-dependentmanners.Floetryshool/L,orphologyunderCLSM.ConclusionTetrandrinecaninhibitproliferationandinduceapoptosisofHeLacervicalcancercells.　　KEYI1640培养基购自GIBCO公司，粉防己碱(Tet)购自上海

4、友思生物技术有限公司，根据文献[7]以双蒸水稀释粉防己碱，配置浓度为0.1mmol/L的粉防己碱储存液(0.1mol/LHCl助溶，0.1mol/LNaOH调整pH值至6.6～6.7)，4℃保存，四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自Amresco公司，Annexin-FITC凋亡检测试剂盒购自美国Bipec公司，胰蛋白酶，二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma公司。　　1.2细胞株和细胞培养　　宫颈癌HeLa细胞株由西安交通大学临床医学研究分子中心提供。常规培养在含100mL/L胎牛血清的RPMI-1640培养基中，培养条件为37℃，50mL/LCO2饱

5、和湿度，待细胞长至80%融合时，2.5g/L胰酶消化传代，取对数生长期细胞进行实验。　　1.3MTT法检测宫颈癌HeLa细胞的增殖抑制率　　取对数生长期的HeLa细胞，调整细胞浓度5×104个/mL，以200μL/孔接种于96孔板，37℃，50mL/LCO2培养箱中培养24h，以粉防己碱终浓度为10、12.5、15、17.5、20、30μmol/L处理细胞。每个浓度设三个平行孔，并同时设阴性对照和空白对照，分别于作用24、48、72h后每孔加入50mg/L的MTT溶液20μL，37℃孵育4h后，终止培养，小心吸去上清，每孔加入150μLDMSO

6、，振荡器震荡10min，使结晶溶解完全，用酶标仪在490nm处测量A值，按以下公式计算细胞增殖抑制率：抑制率(%)=(1-A实验组/A对照组)×100%。　　1.4实验分组　　实验分为对照组和处理组。对照组即正常生长的HeLa细胞；处理组即给予粉防己碱处理的Hela细胞。　　1.5AnnexinV/PI双染法流式细胞数检测细胞凋亡　　以0μmol/L，15μmol/L粉防己碱处理细胞24h后，收集细胞，调整细胞浓度为1×106个/mL。取1mL细胞，2000r/min，4℃，离心10min，弃上清。用预冷的PBS洗涤细胞，400μL1×Bind

7、ingBuffer重悬细胞，密度为1×106个/mL。加5μLAnnexinV-FITC，轻柔混匀，在4～8℃避光孵育15min。再加10μLPI，在4～8℃避光孵育5min。于1h内上流式细胞仪检测。　　1.6AnnexinV/PI双染法激光共聚焦显微镜观察细胞的形态学变化　　将对数生长期HeLa细胞以1×105个/mL接种于预先置有盖玻片的无菌6孔板中，终体积为2.5mL。待24h贴壁后，加入粉防己碱，使其在培养基中终浓度为15μmol/L，同时设不加药的对照组。作用24h后，按AnnexinV-PI细胞凋亡试剂盒步骤染色，封片后立即用激光

8、共聚焦扫描显微镜观察细胞并拍照。结果判定：正常活细胞AnnexinV和PI均为低染；凋亡早期的细胞膜完整，AnnexinV高染呈绿色，PI为低染；凋亡