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1、促甲状腺素化学发光免疫定量检测试剂盒的研制11:王青,王缦,魏东芝,陈寒柏,张黎明【摘要】 目的:研制人血清中促甲状腺素(TSH)的化学发光免疫检测试剂盒。方法:采用辣根过氧化物酶标记的抗TSHβ亚单位特异性单克隆抗体(mAb),与固相包被的抗TSHα亚单位的另一mAb配对,以鲁米诺作为底物,采用两步法建立了双位点夹心法人血清TSH的化学发光免疫定量分析法。结果:该方法灵敏度为0.0788mIU/L,批内CV平均为4.7%,批间CV平均为8.4%,平均回收率为93.05%。该检测与LH、FSH和HCG无交叉反应。部分实验样品的测试结果显示该试剂与国外同类
2、试剂(雅培architecti2000)的测定结果明显相关(r=0.984)。结论:该方法具有较高的灵敏度、重复性和准确度,与其他同类产品相比简便、快捷、成本低,适于临床检测和科研应用。【关键词】促甲状腺激素(TSH)化学发光免疫分析法试剂盒 促甲状腺激素(thyroidstimulatinghormone,thyrotropin,TSH)是一种由垂体前叶分泌的糖蛋白激素,由α和β2个亚基组成,相对分子质量(Mr)为28000[1]。TSH本身受下丘脑分泌的TSH释放激素TRH的调控,TSH的主要生理作用是调节甲状腺激素的合成与分泌,血液中甲状腺激素水平
3、与腺垂体分泌TSH的量之间有负反馈抑制关系[2]。甲状腺功能改变时,TSH的波动较甲状腺激素更迅速且明显,是反映下丘脑垂体甲状腺轴功能的敏感指标,因此采用灵敏度高的TSH免疫分析法具有重要的意义。化学发光免疫分析(chemiluminescentimmunoassay,CLIA)是一种灵敏的免疫分析方法,在免疫诊断试剂研制中已得到了广泛的应用[3]。本研究根据化学发光免疫分析法的原理研制了血清TSH的检测试剂盒,与国内外同类产品相比具有简便、快捷、成本低等优点。 1材料和方法 1.1材料TSH单克隆抗体(mAb)、TSH标准品抗原和辣根过氧化物酶(
4、HRP)为Sigma公司产品,光免板为ThermoElectron公司产品,化学发光底物为BioRad公司产品。 1.2方法 1.2.1标准品的配制将TSH抗原标定后溶于小牛血清中,配制成含0.1,1,5,20,100mIU/L的标准溶液。 1.2.2抗体包被板的制备将100μL含TSHmAb(0.5mg/L)的pH9.6碳酸盐缓冲液加至包被板中,37℃包被2h,再用含10mg/LBSA的0.01mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液于37℃封闭2h后晾干备用。 1.2.3酶标记物的制备TSH的酶标记物采用过碘酸钠法制备,然后经0.01mol/LpH7.
5、4磷酸盐缓冲液透析过夜后,加入等量的甘油于-20℃保存备用。 1.2.4检测方法将50μL待测样品或标准品加入包被TSH的光免板中,37℃温育30min,弃反应液,用洗涤液(含0.5mg/LTol/LpH7.4磷酸盐缓冲液)洗5次,加酶标记物50μL,37℃温育30min后同样用洗涤液洗5次,然后加入发光底物于5~10min内测定各孔的发光值RLU。样本中的TSH浓度依据由标准品TSH浓度和对应的RLU建立的数学模型进行定量。 2结果 2.1动力学性质在HRP鲁米诺H2O2发光体系中,将不同量的免疫复合物加入发光液中,发光强度(RLU)随反应时间
6、而变化。10min后RLU接近峰值,在5~15min内RLU较为稳定,随后开始缓慢下降。 2.2反应条件优化 2.2.1加样量对RLU的影响样本和酶标记物的加样量分别为50μL和100μL考查标准品(0、0.1、1、5、20、100mIU/L)RLU,发现加样量为100μL与50μLRLU相差不大,说明50μL的加样量反应能达到平衡(图1)。 图1加样量对RLU的影响(略) 2.2.2反应模式对RLU的影响采用二步法。第一步:加入标准品和待测样品后,将反应体系在37℃分别温育15、30、45、60min;第二步:加入酶标记抗体后,将反应体系在37℃
7、分别温育15、30、45、60min。结果表明温育时间为30min时反应皆能达到平衡(图2)。 图2温育时间对RLU的影响(略) A:第一步温育时间对RLU的影响;B:第二步温育时间对RLU的影响. 2.3稳定性将试剂盒放置于37℃6d后,比较与放置前参考标准品各点RLU值,参考标准品各点RLU值未见明显降低,且本底发光值无明显升高,表明试剂盒标准曲线无明显漂移,满足稳定性要求。 2.4.3准确性在已知TSH浓度的血清中加入3种不同浓度的标准血清,测定加入回收率为93.05%。将TSH浓度为44.42mIU/L的血清用标准零血清分别按1/2、1/4
8、、1/8、1/16稀释,测量各稀释浓度的TSH含量,测定稀释回收率