cxcr4-sdf1对乳腺癌细胞mcf7增殖作用的影响

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1、CXCR4/SDF1对乳腺癌细胞MCF7增殖作用的影响【关键词】CXC趋化因子受体4基质细胞衍生因子MCF7细胞CXCR4单克隆抗体增殖　　0引言　　近年研究表明，肿瘤细胞可以表达某些趋化因子（chemokines）或趋化因子受体，并且趋化因子及其受体可能通过与炎症细胞浸润相似的机制参与肿瘤细胞的发生、发展与侵袭转移过程［1-2］.CXC趋化因子受体4（CXCchemokinereceptor4，CXCR4）与其配体-趋化因子CXCL12，即基质细胞衍生因子1（stromalcellderivedfacto

2、r1,SDF1）相互作用构成一个细胞信息传递的生物学轴（biologicalaxis），决定着肿瘤细胞的生长与转移过程［3］.目前，肺癌、卵巢癌、乳腺癌、白血病等众多肿瘤细胞中均发现有CXCR4的高表达，并且CXCR4已成为肿瘤诊断与治疗的新靶点，越来越多受到人们的重视［4］.已有研究表明，CXCR4/SDF1生物学轴不仅对乳腺癌细胞的转移起关键作用［3］，而且与乳腺癌细胞的生长也有着密切的联系［5-6］.我们以乳腺癌细胞系MCF7为研究对象，采用CXCR4mAb进行体外实验性干预，观察MCF7细胞的生

3、长能力及细胞增殖相关蛋白的变化，以阐明CXCR4/SDF1生物学轴对乳腺癌细胞增殖的影响.　　1材料和方法　　1.1材料　　人乳腺癌细胞系MCF7由第四军医大学航空航天医学系谢满江博士惠赠；CXCR4mAb（IgG2b44717.111clone)购于美国Sigma公司；噻唑蓝（tetrazoliumblue，MTT）、碘化丙啶（propidiumiodide,PI）为美国Sigma公司产品；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗、羊抗鼠FITCHRP抗体与鼠抗人增殖细胞核抗原（proliferatingcelln

4、ucleusantigen,PA）抗体购于北京华美公司.MCF7细胞用RPMI1640（含100mL/L胎牛血清）在37℃，50mL/LCO2孵箱中常规培养.　　1.2方法　　1.2.1MCF7细胞CXCR4蛋白的表达取对数生长期的MCF7细胞，加入RIPA(RadioImmunoprecipitationAssay，美国Pierce)裂解液.冰上静置10min后，以4℃，10000r/min离心5min后取上清.采用BCA法（BCAproteinassayreagentkit，美国Pierce）进行蛋白

5、定量后，蛋白样品加入等体积的2×SDS凝胶上样缓冲液混匀，置于沸水浴中加热10min.蛋白样品（每孔上样量均为20μg总蛋白）以80mg/LSDS聚丙烯酰胺凝胶（Novex,SanDiego,美国CA）进行电泳分离，分离的蛋白条带转移至硝酸纤维素膜（hybondECLmembrane,美国AmershamLifeScienceInc.,ArlingtonHeights,IL）上.4℃以含100g/L脱脂奶粉的TBST封闭过夜后，加入用封闭液稀释的CXCR4mAb（1∶1000）室温孵育1h；以TBST洗膜3×

6、10min；以TBS稀释辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠二抗（1∶5000），室温孵育1h后，以TBS洗10min×2.最后用增强的化学发光反应混合液（enhancedchemiluminescence，ECL，美国Pierce）显色，感光胶片（hyperfilmECL,美国AmershamLifeScienceInc.,ArlingtonHeights,IL）曝光.　　1.2.2MCF7细胞生长能力取对数生长期的MCF7细胞以2.5g/L胰酶消化，再以5×106/L的细胞密度接种于96孔板.37℃，50mL/L

7、CO2条件下培养过夜后，加入含有50mg/LCXCR4mAb的培养液（根据预实验结果，选取50mg/L作为实验浓度)，空白对照组加相应体积的培养液.MCF7细胞分别培养24，48，72，96h后，加入终浓度为5mg/L的MTT10μL，继续培养4h后吸取培养液，每孔加入DMSO150μL溶解结晶，充分振荡15min，用酶联免疫检测仪测定各孔490nm吸光度值（A490）.绘制各组生长曲线并计算细胞存活率.细胞存活率＝实验组各孔平均A490值/相应对照孔平均A490×100％.另取对数生长期的MCF7细胞以2.

8、5g/L胰酶消化，再以400个/孔的细胞密度接种于已制备好琼脂培养基的6孔板中.培养过夜后，以50mg/LCXCR4mAb作用48h后，再以含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液继续培养14d.计数每组克隆数（50个细胞以上为一个克隆），克隆形成率＝平均克隆数/接种细胞数×100％.　　1.2.3流式细胞仪测定细胞周期以50mg/L的CXCR4mAb作用MCF