rkip介导的erk通路在电磁辐射致海马神经元损伤中的作用

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1、RKIP介导的ERK通路在电磁辐射致海马神经元损伤中的作用【摘要】目的:研究电磁辐射对原代培养海马神经元Raf激酶抑制蛋白(RKIP)和磷酸化ERK表达的影响,应用MEK的抑制剂U0126探讨RKIP介导的ERK通路在辐射损伤中的作用。方法:体外培养原代海马神经元,采用XHPM、SHPM及EMP作为辐射源,分别建立3种电磁辐射细胞模型。通过免疫荧光标记、激光扫描共聚焦显微镜检测RKIP和磷酸化ERK的表达;利用AnnexinVPI双标记、流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡与坏死率。结果:三种电磁辐射后海马神经元RKIP表达均减少,磷酸化ERK表达均增加,且胞核

2、移位发生,辐射组间均未见明显差异;U0126预处理组较单纯辐射组神经元的凋亡与坏死率明显降低,但仍高于假辐射组。结论:RKIP介导的ERK通路过度激活是电磁辐射致海马神经元凋亡与坏死的重要机制之一,U0126对电磁辐射损伤具有一定防护作用。【关键词】电磁辐射海马神经元RKIPERK原代培养　　Raf激酶抑制蛋白(rafkinaseinhibitorprotein,RKIP)作为调控多种信号转导通路的中心信号蛋白,在细胞的生长、分化、增殖和凋亡中扮演重要角色,其中RKIP介导的Raf/MEK/ERK信号通路对于肿瘤细胞的存亡至关重要。我们前期的研究发现,电磁辐射后大

3、鼠海马RKIP表达明显下调［1］,但是对于RKIP在电磁辐射致海马损伤中的作用机制及其介导的ERK通路在辐射损伤中的作用尚未见报道。为此,本研究中选用近年来应用较为广泛的X波段高功率微波(Xbandhighpoicroicroagicpulse,EMP)作为辐射源,通过细胞培养、免疫细胞化学染色、激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)、AnnexinVPI双标记、流式细胞术(FCM)及图像分析等手段,研究电磁辐射对原代海马神经元RKIP和磷酸化ERK表达的影响,并应用MEK的特异性抑制剂U0126探讨RKIP介导的ERK通路在辐射损伤中的作用,为阐明电磁辐射损伤机制

4、和揭示3种电磁辐射损伤效应的异同提供依据,并为辐射损伤的防诊治开辟新途径。　　1材料和方法　　1.1材料EM培养基、N2supplement、B27supplement均为Invitrogen公司产品;马血清购自Hyclone公司;胰蛋白酶、谷氨酰胺、阿糖胞苷均为Amersco公司产品;兔抗神经元特异性烯醇化酶(neuronspecificenolase,NSE)、兔抗RKIP、FITC或Cy3标记的羊抗兔IgG抗体均为SantaCruz公司产品;U0126购自Promega公司;Hoechest33342购自Sigma公司;AnnexinV细胞凋亡检测试剂盒

5、购自北京宝赛生物技术有限公司;FCM为美国BD公司产品;LSCM为BioRad公司产品。　　1.2方法　　1.2.1原代海马神经元培养与鉴定出生12h内EM、100mL/L马血清、10g/L谷氨酰胺、青霉素105U/L、链霉素105U/L、10g/LN2和20g/LB27。于37℃、50mL/LCO2及饱和湿度的培养箱内培养,至第3天加入阿糖胞苷(3mg/L)抑制胶质细胞过度增殖,24h后全量换液,以后每周半量换液2次,培养至7～10d用于实验。采用NSE抗体,以免疫细胞化学ABC法染色进行神经元鉴定。　　1.2.2细胞分组与辐射条件将原代海马神经元随机分

6、为假辐射组(Control)、EMP组、SHPM组、U0126＋SHPM组、XHPM组及U0126＋XHPM组,分别采用HPM和EMP模拟源辐射细胞,SHPM和XHPM平均功率密度均为100mP场强为6×104V/m,辐射时间均为4min。假辐射组进行同等条件伪辐射。　　1.2.3U0126给予方法参照试剂说明书,于辐射前30min,向细胞培养皿中加入MEK的特异性抑制剂U0126,其终浓度为10μmol/L。　　1.2.4免疫荧光染色检测RKIP和磷酸化ERK辐射后6h,以1∶1甲醇丙酮液固定细胞(4℃,10min);1g/L胰蛋白酶作用3min;经

7、100mL/L羊血清封闭15min后,滴加1∶100稀释的兔抗RKIP或磷酸化ERK,4℃过夜;滴加1∶100稀释的FITC或Cy3标记的羊抗兔IgG,室温孵育1h;滴加1∶1000稀释的Hoechest染液,避光反应10min;上述各步骤之间均以PBS漂洗5min×3次。以1∶1甘油PBS封片后,应用LSCM上机观察,并采集图像。以PBS分别代替一抗和二抗作为阴性对照,并以PBS同时代替一抗和二抗设立自发荧光对照,其余步骤同上。利用ImagePro5.0软件对荧光图像进行定量分析,每组选取20个细胞。阳性结果FITC标记呈绿色,Cy3标记呈红色,胞核呈蓝色。　　

8、1.2.5