云纹石斑鱼染色体制备实验

《云纹石斑鱼染色体制备实验》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、云纹石斑鱼染色体制备实验　　云纹石斑鱼是一种暖水性中下层鱼类，主要分布于中国的东海和南海，因其具有肉味鲜美等优点，是上等的食用鱼类[1]目前已经成为福建、广东、山东等沿海地区的重要养殖品种，具有很高的经济价值。　　染色体作为遗传信息的载体，在数目以及形态上具有物种独有的特征。也在一定程度上反应了该物种的进化历史。物种在进化过程中所发生的遗传物质的变化，常以染色体数目以及类型的变化为特征。鱼类的染色体研究是细胞遗传学的一项主要研究内容，在分类学方面对于弄清鱼类的亲缘关系，分化过程等具有重要的意义[2].　　在细胞遗传学研究中，染色体的制备是一项基本技术。可用于研

2、究鱼类的遗传变异、性别决定、杂交育种以及检测环境污染等多个方面。近些年来，鱼类染色体制备方面的研究取得了较快的发展，目前已有多种方法可以制备染色体。沙珍霞[3]等以花鲈为材料，比较了外周血培养法、细胞培养法、头肾-PHA注射法、头肾-PHA注射-淋巴分离液富集法、小鱼游泳法、组织浸泡法等六种制备染色体的方法，力求找出染色体形态清晰、数目完整、无杂质干扰的染色体制备方法。其中细胞培养法以及淋巴液分离富集法达到了上述要求。　　目前在我国，已有关于云纹石斑鱼生物学特性[4]、胚胎发育[5]、人工繁殖及规模化饲养[6]等方面的报道，但关于细胞遗传学以及染色体研究方面目

3、前尚未有报道。本研究首次利用细胞培养法进行了云纹石斑鱼染色体制备，以期为这一珍贵的鱼种在后续的遗传育种、性别控制研究、荧光原位杂交以及染色体核型研究等工作提供基础资料。　　1材料与方法　　1.1主要试剂与材料　　（1）0.075mol/LKCl低渗液：称取1.677g氯化钾粉末溶于300ml灭菌水中溶解。　　（2）卡诺氏固定液：V甲醇：V冰乙酸=3:1（甲醇与冰乙酸按3:1体积比混合）（3）胰蛋白酶消化液：使用前在37℃恒温水浴中预热。　　（4）6-50代云纹石斑鱼脑细胞系，由黄海水产研究所细胞室建立，在20℃条件下培养至对数生长期。　　1.2实验方法　　（1

4、）秋水仙素处理：在细胞传代结束后48小时，向细胞培养瓶中加入秋水仙素溶液，使得秋水仙素终浓度为10μg/ml,轻轻摇匀。将细胞培养瓶放入24℃恒温培养箱中培养6小时。　　（2）收集细胞：将100μL预热至37℃的胰蛋白酶消化液加入培养瓶中，将收集管放入离心机，按1200r/min设定转速，离心5min,弃掉上层清液，收集得到的细胞沉淀。　　（3）低渗悬浮：加入7mlKCL溶液，轻轻吹打，将收集管放入37℃恒温水浴锅内，低渗悬浮细胞30-35min.　　（5）固定：低渗结束后，缓慢加入1-2ml卡诺氏固定液，轻轻摇匀。1200r/min离心5min,

5、弃上清，收集细胞，再次加入6ml卡诺氏固定液，悬浮固定细胞，冰浴30min.1500r/min离心5min,弃上清，加入2ml以内的卡诺氏固定液，冰浴30min.　　（6）滴片：采用冷滴片法滴片，将在-20℃冰乙醇中保存的载玻片取出甩干，置于冰盒之上。使用移液器进行滴片，保持滴片高度≥50cm,每片载玻片上滴落2-3滴细胞固定液，在室温环境下自然晾干即可。　　（7）染色：配好的10%吉姆萨染液（900μL1PBS+100μL吉姆萨原液）染色10min,自来水滴小心冲去玻片上的染液，常温下自然晾干。　　（8）观察：用Nikon80i显微镜进行观

6、察，先用低倍镜查找分裂像，之后用油镜观察并拍照。　　2结果　　使用本方法，我们获得了较好的云纹石斑鱼细胞中期分裂相，各条染色体分散较开，形态良好。为以后的染色体计数、核型分析以及后续的荧光原位杂交工作提供了基础。　　染色体计数及核型分析：Giemsa染色之后，我们在显微镜下选取100个中期分裂相来确定染色体数目，并选取10个数目完整，分散良好图像清晰的分裂相进行拍照（图1）。中期分裂相镜检结果表明，在统计的100个分裂相中，染色体数目从30到92不等，染色体数目出现非整倍性。但是48条正常二倍体染色体出现的频率最高，其所占比例为65%,因此可以表明，云纹石斑鱼

7、二倍体染色体众数是48,即2n=48.（图2）　　3讨论　　根据国内对海水鱼类染色体组型的研究结果来看，我国海水鱼类的染色体主要类型为2n=48（占已报道的72%）[7].与已经报道过的石斑鱼类染色体以及本研究在结果上相符。　　根据以往研究人员在制备染色体过程中所总结的经验来看，无论是采用哪种方法制备鱼类染色体，以下几点都需要注意：　　（1）选取合适的材料制备染色体：近些年来，染色体制备技术发展较快，外周血培养细胞、肾-PHA短期注射培养细胞、细胞系、活体组织、胚胎等细胞分裂旺盛的器官和组织都可以用来制备染色体。对于一些体型较大的鱼，头肾组织明显，容易取得，可

8、以用来制备染色体。有些鱼体型较小，头肾