rassf1a基因表达对肝癌细胞化疗药物敏感性的影响

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1、RASSF1A基因表达对肝癌细胞化疗药物敏感性的影响：芮理，薛万江，李鹏，王鹏，王志伟，李厚祥【摘要】　　目的：研究RASSF1A提高肝癌细胞化疗药物敏感性的作用。方法：通过脂质体介导的基因转染法将RASSF1A基因的真核表达载体及空载体转染肝癌细胞株QGY-7703，G418筛选稳定表达株，并以RT-PCR和)、丝裂霉素(MMC)、鬼臼乙叉甙(VP-16)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、顺铂(DDP)分别作用各细胞株后，检测各细胞株的生长抑制率。结果：经800μg/ml的G418最佳筛选浓度筛选QGY-7703细胞株，成功建立稳定表达RASSF1A基因的肝癌细胞株。以

2、QGY-7703细胞为对照，MMC对表达RASSF1A基因的肝癌细胞的生长抑制率最大为21%。结论：RASSF1A基因的表达可明显提高肝癌细胞对MMC的敏感性。RASSF1A的表达不影响肝癌细胞QGY-7703对ADM、VP-16、5-FU和DDP敏感性。【关键词】肝细胞癌Rasassociationdomainfamily1A药物敏感性逆转录聚合酶链反应　　[Abstract]Objective：ToinvestigatetheeffectsofRASSF1Ageneexpressiononthechemosensitivityofhumanhepatocellu

3、larcarcinomacell（HCC）.Methods：RASSF1Aexpressionvectorandemptyvectorine2000reagents.ThepositiveclonesthatexpressedRASSF1AgenestablyeasuredafterthetreatmentoragentsADM,MMC,VP-16,5-FUandDDP.Results：TheHCCcelllinesthatreexpressedRASSF1AgenestablylforQGY-7703cellline.Afterbeingtreatedaximal

4、，anditosensitivityofhumanhepatocellularcarcinomacelltreateda;Rasassociationdomainfamily1A;Drug-sensitivity；RerversetranscriptasepolymerasechainreactionRASSF1A（rasassociationdomainfamily1A）基因是近年来发现的一个重要的抑癌基因，其抑制肺癌、肾癌、膀胱癌细胞生长的功能已得到证实[1~3]。通过瞬时转染发现，RASSF1A基因的表达使肺癌细胞株NCI-H1299生长阻止在G1/S期与抑制

5、细胞周期蛋白cyclinD1的表达累积有关[4，5]。但对于RASS-F1A基因的表达对化疗药物敏感性的研究国内外尚未见报道，本研究通过建立稳定表达RASSF1A基因的肝癌细胞株，观察RASSF1A基因表达对肝癌细胞化疗药物敏感性的影响。　　1材料和方法　　1．1质粒、细胞株及主要试剂pcDNA3.1(+)RASSF1A质粒由美国Pfeifer博士惠赠[1]。真核表达载体pcDNA3.1(+)购自Invitrogen公司，肝癌细胞株QGY-7703由国家人类基因组南方研究中心常规保存，用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养。所有细胞均在37.0℃、5%CO2及饱和湿

6、度的培养箱内培养。脂质体Lipofectamine2000、G418、TrizolRNA抽提试剂、二抗羊抗鼠IgG-HRP均购自Gibco公司；一抗鼠抗人RASSF1A单克隆抗体购自eBioscience公司；RNA逆转录酶SuperScriptⅡreversetranscriptase购自Clothe公司；CellTiter96（R）AQueousNon-RadioativeCellProliferationAssay试剂盒购自Progema公司。　　1．2G418对肝癌细胞株的毒性试验各细胞株按1×105/孔接种于6孔板，细胞贴壁后，按0、200、400、600

7、、800、1000μg/ml的G418浓度加入相应培养基，每周换液2次，2周后弃培养基。　　1．3稳定表达株的建立严格参照Lipofectamine2000说明书，将纯化的质粒pcDNA3.1(+)RASSF1A（经测序鉴定）及pcDNA3.1(+)各2μg转染对数生长期的QGY-7703，转染后20h换新鲜培养基，48h后以1︰10稀释传代培养，72h后按相应浓度的G418进行筛选。待转染细胞呈小克隆生长时，用Disco纸片将G418抗性细胞克隆依次转到96孔板、24孔板、6孔板或35mm培养皿中扩大培养。收集细胞蛋白，RT-PCR和WesternBlot鉴定