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次声对雄性小鼠睾丸细胞DNACpG甲基化水平的影响：高柳村，陈彩云，周鹏，陈景藻，舒青【关键词】次声；小鼠；睾丸细胞；甲基化【Abstract】AIM:ToinvestigatethechangesofgenomeDNAmethylationoftesticularcellsinmiceanceliquidchromatography(HPLC)afterinfrasoundexposure,andtoexploretherelationsbeticeeDNAmethylationoftesticularcellsinthemiceeDNAmethylationoftesticularcellinexposedgroupsearkedlyaffectsthegenomeDNAmethylationoftesticularcells.Thesechangesarepositivelyassociatede.【Keyice;testiscell;methylation【摘要】目的：应用高效液相色谱分析技术对次声作用后小鼠睾丸细胞基因组DNACpG甲基化的变化进行分析，以研究次声作用与表遗传学改变的关系.方法：采用8Hz,130dB的次声分别作用于1,7和14d组3个实验组,各雄性Balb/c小鼠20只，每日次声暴露2h.同时设对照组，并利用高效液相色谱分析技术对实验组与对照组的小鼠睾丸细胞基因组DNACpG甲基化水平进行检测.结果： 次声暴露1,7和14d组的小鼠睾丸细胞基因组DNACpG甲基化程度均低于对照组，并随次声作用时间的变化而改变，分别为0.0150±0.0127vs0.0235±0.0062,0.0140±0.0030vs0.0273±0.0040,0.0150±0.0096vs0.0250±0.0049（P=0.000）.结论：次声作用可致睾丸细胞基因组DNACpG甲基化的改变，与次声暴露时间有关.【关键词】次声；小鼠；睾丸细胞；甲基化0引言高强度次声可致生物体组织和器官的损伤，可使日常生活和战斗能力受到影响.表遗传学是研究没有DNA序列变化、可遗传的、稳定的基因表达（修饰）的改变.次声是否可致生殖细胞表遗传学变化尚未见报道.本实验我们采用第四军医大学研制的次声压力舱系统，观察在一定声压级水平的次声作用下小鼠睾丸细胞基因组DNACpG甲基化的变化情况，以研究次声的损伤与表遗传学改变的关系，为探讨次声对人体的危害及制定预防措施提供一定的依据.1材料和方法1.1仪器设备次声声源及检测系统采用第四军医大学在中国科学院声学研究所和航天工业总公司第41所的指导和协作下建成的、声源为电动扬声器式次声压力舱系统及检测系统.次声压力舱系统由低频信号发生器、功率放大器和电动扬声器组成. 检测系统主要包括次声传声器和次声信号数据采集分析系统.1.2实验动物及分组健康雄性Balb/c小鼠90只(体质量18～20g)，我校实验动物中心提供.分笼饲养于安静舒适的环境下(基础噪音不高于40dB)，标准饲料喂养，自由饮水.小鼠随机分为1,7和14d共3组，每组20只，每天暴露于次声压力舱产生的8Hz,130dB声压场中2h；对照组每组10只，按上述3个时间点每天在次声舱内无作用放置2h.1.3睾丸组织DNA提取与鉴定各组于次声作用完毕后当日用脊椎脱臼法处死小鼠.摘取睾丸组织，将1.0g组织放入研钵中磨碎，加DNA提取液10mL（含10mL/LTrisClpH8.0,0.1mol/LEDTA,pH8.0,0.5g/LSDS），蛋白酶K消化，55℃水浴过夜，饱和酚/氯仿法抽取DNA，冰乙醇沉淀DNA，常温晾干，加水溶解，紫外分光光度计检测DNA浓度及纯度.1.4HPLC基因组甲基化检测将100μg基因组DNA和100μL400mL/L的氢氟酸(HF，优级纯，上海致冷剂厂)混匀，80℃温育12h后开盖置40℃烘箱至液相完全蒸发，随之加新鲜配制的0.02mo1/LpH为2.3的NH4H2P04100μL.碱基水解后，采用包括自动紫外监测及积分仪的C/(5mC十C)的百分数检测总基因组DNA中5mC的含量即DNA甲基化的水平［1］. 检测开始前分别用A，T，G，C与5mC的标准品过柱［2］，确定5mC与C峰值出现的时间.统计学处理：数据用x±s表示,采用SPSS12.0统计软件分析.1,7和14d暴露组与对照组组间用方差分析.P<0.05为差异有统计学意义.2结果次声作用1,7和14d后各暴露组与相应对照组比较DNA甲基化均有不同程度的降低，并随次声作用时间的增加而改变.次声作用使暴露组与对照组之间DNA甲基化的程度差异有统计学意义（P=0.000），而各组间DNA甲基化的程度差异不明显（P=0.269，表1）.表18Hz/130dB次声暴露后小鼠睾丸细胞DNACpG甲基化水平的变化（略）魏亚宁等［11］报道次声暴露对小鼠睾丸组织细胞及其超微结构的影响，损伤以次声参数为8Hz/130dB最为严重，在7和14d组中出现了大量的畸形精子.我们实验选取能使小鼠睾丸支持细胞、间质细胞及生精细胞损伤现象最为严重的8Hz/130dB次声作用小鼠，并观察在该声压级水平的次声条件下，暴露不同时间后小鼠睾丸细胞基因组DNA甲基化的变化情况.结果表明小鼠睾丸细胞基因组DNA甲基化的水平与次声的暴露与否密切相关，并随暴露时间的增加而改变. 这种甲基化的调节过程出现在机体应激损伤修复的早期阶段，低甲基化可能易于发生各种修复基因的转录翻译，进而增强表达功能性蛋白，通过此种方式以加强睾丸细胞对抗外界次声损伤的能力，随后小鼠睾丸组织对次声作用产生适应性.结果提示次声作用与基因组DNA甲基化的水平具有正态的量效关系.由本实验推测低甲基化可作为次声导致睾丸组织细胞损伤的早期检测指标之一，对次声损伤及其严重程度的评价具有较重要的诊断提示价值，但次声共振反应后的睾丸细胞甲基化水平的普遍降低值得进一步研究.【参考文献】［1］房静远，萧树东，李蓉蓉，等.HPLC检测胃癌DNA甲基化的初步研究［J］.中国肿瘤临床,1997,24(7):538-540.［2］HermannA,SchmittS,JeltschA.ThehumanDnmt2hasresidualDNA(cytosineC5)methyltransferaseactivity［J］.JBiolChem,2003,278(34):31717-31721.［3］陈景藻.次声产生及生物学效应［J］.国外医学・物理医学与康复学分册,1999,19(1):9214.［4］KrivolesovaSA,SvidovyiVI,LobovGI,eta1.Effectsofinfrasoundandnoiseoncontractilityoflymphaticvessels［J］.MedTrPromEkol,2001,2:16-20. ［5］王冰水,陈景藻,刘斌,等.次声暴露对L929细胞膜影响的原子力显微镜观察［J］.中华劳动卫生职业病杂志,2005,23(6):428-430.［6］Choocysteinontheproductionofnitricoxideinendothelialcells［J］.ClinExpPharmacolPhysiol,1999,26(10):817-818.［7］幺晓轶,裴兆辉,朱妙章，等.8Hz/90dB次声暴露后心肌细胞凋亡及其相关机制研究［J］.第四军医大学学报,2006,27(6):490-492.［8］谭永霞,李玲,陈景藻,等.次声对大鼠海马5HT,5HTR,RyR表达及恢复的研究［J］.中华神经外科疾病研究杂志,2005,4(4):324-327.［9］刘秀敏，甄荣，陈惠芳，等.次声对小鼠生育能力与免疫功能的影响［J］.中华物理医学与康复,2000,22(2):100-103.［10］冯勃，姜泗长，杨伟炎，等.强次声波对豚鼠Corti器超微结构的损伤［J］.中华耳科学杂志,2006,4(1):65-68.［11］魏亚宁，刘静，舒青，等.次声暴露对小鼠睾丸细胞超微结构的影响［J］.中华男科学,2002,8(5):323-328.
