白藜芦醇诱导大鼠原代脂肪细胞凋亡及机制

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1、白藜芦醇诱导大鼠原代脂肪细胞凋亡及机制：陈思凡，周妮曼，郑琳，柯梁汝，单智铭，冯翔【摘要】【目的】探讨白藜芦醇(Res)对大鼠原代脂肪细胞凋亡的影响及其机制。【方法】培养大鼠原代脂肪细胞，添加不同剂量的Res干预，用Hoechst33258染色，在荧光显微镜下观察细胞核形态;用DNALadder实验观察DNA断裂的条带;检测各组培养基和细胞内的乳酸脱氢酶(LDH)含量，计算LDH漏出率;用流式细胞仪测定细胞凋亡率;ethods】Ratprimaryadipocytesorphologicaltransformat

2、ioninedicroscope.DNALadderassaycellapoptosis.TheLDHcontentinmediumandcellseasuredtocalculatetheLDHleakingratio.Thenumberofapoptoticcellsetry.Theexpressionofsilentinformationregulator1(Sirt1)，CytochromeC，CleavedCaspase9，CleavedCaspase3inedusingSO溶解，配置成80mmol/L

3、的储备液，DMSO在培养基的终浓度低于0.1%)，DMSO，Ⅰ型胶原酶，Hoechst33258，购自美国Sigma公司;高糖DMEM培养基，新生牛血清，购自美国Gibco公司;DNAmarker，DNALadder检测试剂盒，购自上海Beyotime公司;LDH检测试剂盒，购自南京建成生物工程研究所;细胞凋亡测定试剂盒，购自美国BD公司;兔抗Sirt1单克隆抗体，购自英国abcam公司;兔抗CytochromeC、CleavedCaspase9、CleavedCaspase3单克隆抗体，购自美国CST公司;兔抗

4、GAPDH单克隆抗体，购自武汉Boster公司;细胞浆蛋白抽提试剂盒，BCA试剂盒，HRP标记的抗兔二抗，购自上海Beyotime公司。　　1.2方法　　1.2.1大鼠原代脂肪细胞的培养　　雄性SD大鼠10只，体质量160～180g，购自广东省实验动物中心。原代脂肪细胞分离与培养实验过程：取大鼠1只，麻醉处死后无菌分离附睾脂肪组织，以眼科剪剪200～300次，剪碎至1mm3以下，用1.5g/L的Ⅰ型胶原酶消化细胞，放入水浴摇床，100～120r/min，37℃水浴消化约40min，100目的网过滤，静置于离心管约

5、5min，脂肪细胞自然上浮，将成熟的脂肪细胞用培养基重复洗2次，在培养管中加入无酚红的DMEM培养基(100mL/L新生牛血清、100IU/mL青霉素、100IU/mL链霉素)，观察细胞状况。取3只SD大鼠，按以上方法分离培养原代脂肪细胞，按照下面的实验方法添加不同剂量的Res，在37℃、体积分数为5%的CO2、95%湿度的细胞培养箱里进行细胞培养和干预试验。各实验重复3次。　　1.2.2Hoechst33258染色　　细胞用20、40、80μmol/L的Res作用12h，对照组添加相等量的DMSO作为参照，药物

6、处理完毕后用PBS洗涤2次，用甲醇/冰醋酸(3：1)于4℃固定10min，洗涤后用Hoechst33258(浓度为5mg/L)避光染色15min。用PBS洗涤1次。进行细胞计数后，取约6000个细胞均匀涂在载玻片上，用甘油封片后在荧光显微镜下观察并拍照(激发波长340nm，发射波长420nm)。　　1.2.3DNALadder实验　　细胞经过20、40、80μmol/L的Res干预6h或12h后，按照DNALadder试剂盒说明书，利用离心柱抽提法，抽提并纯化各组细胞的DNA，取20?滋L的DNA样品，加6×DN

7、A上样缓冲液(体积分数30%甘油，0.25%溴酚蓝)，在质量分数1.5%的琼脂糖凝胶(含0.5?滋g/mL溴化乙锭)中进行电泳(40V，电泳约3h)，染料泳动至2/3处。在凝胶成像分析仪上对凝胶进行拍照，观察DNALadder的形成。　　1.2.4乳酸脱氢酶含量的检测　　收集各组的培养基和细胞，细胞在PBS中重悬，通过超声裂解细胞，按照LDH检测试剂盒说明书，检测并计算各组培养基和细胞内的乳酸脱氢酶(lacticdehydrogenase，LDH)含量。LDH漏出率(%)=c培养基(LDH)/(c培养基(LDH)

8、+c细胞内(LDH))。　　1.2.5流式细胞仪测定细胞凋亡率　　细胞经20、40、80μmol/L的Res干预12h后，收集各组细胞，按照细胞凋亡率测定试剂盒的方法，分别添加AnnexinV和7-AAD，处理后在流式细胞仪上测定细胞凋亡率。　　1.2.6CytochromeC、CleavedCaspase9、CleavedCaspase3的蛋白表达　　用NP40裂解细胞