睾丸生精功能局部调节因素的改变对衰老大鼠生精功能的影响

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1、睾丸生精功能局部调节因素的改变对衰老大鼠生精功能的影响：牛嗣云王小杰高福禄陈志宏陈龙周晓春许倩【摘要】目的探讨睾丸生精功能局部调节因素睾酮、胰岛素样生长因子1(IGF1)、表皮生长因子受体(EGFR)的改变对衰老大鼠生精功能的影响。方法用D半乳糖连续腹腔注射制作亚急性衰老大鼠模型，采用放射免疫分析法检测血清中睾酮含量；免疫组织化学法检测大鼠睾丸组织EGFR的表达；原位杂交法观测大鼠睾丸组织IGF1mRNA的分泌情况，并观察大鼠精子数量、活动度和存活率。结果衰老大鼠血清睾酮明显下降，睾丸组织IGF1mRNA、EGFR表达明显减少，与正常对照组比较

2、差异显著(P＜0.01)；衰老大鼠精子的活动度、存活率和精子的数量均比正常对照组显著降低(P＜0.01)。结论睾丸生精功能局部调节因素IGF1mRNA、EGFR表达及血清睾酮的含量的改变，能够影响大鼠睾丸生精功能。【关键词】睾丸；IGF1；EGFR；睾酮【Abstract】ObjectiveToexploretheeffectsoflocalregulationfactorschanges,suchastestosterone(T),IGF1andEGFR,onspermatogenicfunctionofagingrats.MethodsThes

3、ubacutelyagingmodelratsadebyinjectingDgalintoabdominalcavitycontinually.Radioimmunity,immunohistochemicalmethodandinsituhybridizationRNAintestesrespectively.Sperumcounts,motilityandsurvivalratealrats,theTlevelinserumofagingrats,theexpressionofEGFRandIGF1mRNAintestesofagingrats

4、decreasedsignificantly(P＜0.01).Sperummotility,survivalrateandcountsofagingratsRNAandTlevelinserum,canaffectspermatogenicfunctionofagingrats.【KeyRNA和EGFR表达的观察，初步探讨了睾丸生精功能局部调节因素的改变对衰老大鼠生精功能的影响。　　1材料与方法　　1.1动物　　实验选用8周龄清洁级SD雄性大鼠20只(由北京大学医学部实验动物科学部提供)，体重180～220g，随机分为：正常组，模型组，各10只。正常组连

5、续腹腔注射生理盐水60d，每天1次；模型组用生理盐水配6%的D半乳糖溶液，连续腹腔注50d，按300mg·kg-1·d-1给药，每天1次，制作亚急性衰老动物模型。　　1.2药品与试剂　　EGFR抗体购自北京中杉金桥生物有限公司；IGF1原位杂交检测试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；睾酮购自中国人民解放军放免技术中心；D半乳糖购自北京化学试剂公司。　　1.3标本处理　　将大鼠用4%多聚甲醛灌注，取双侧睾丸，放入4%多聚甲醛中(原位杂交的标本用含有1∶1000DEPC的4%多聚甲醛，0.1mol/LPBS，pH7.4，固定2h)4℃冰箱过夜，常规石

6、蜡包埋，连续切片，贴附于APES浸泡过的载玻片上，分别用于免疫组织化学和原位杂交。　　1.4免疫组织化学染色　　切片脱蜡至水，3%H2O2甲醇液浸泡去除内源性过氧化物酶，滴加1∶10正常羊血清，置湿盒中37℃孵育20min，弃血清，1∶100稀释的一抗EGFR，湿盒中4℃冰箱过夜，滴加生物素标记的二抗工作液，37℃孵育1h,滴加HRP标记的链酶卵白素工作液，37℃孵育30min，DAB反应液中显色，上述各步骤之间均用0.1mol/LpH7.4的PBS浸洗3次，每次5min，苏木素复染，透明，封片。　　1.5原位杂交染色步骤　　切片脱蜡至水，3%H2O2

7、1份+蒸馏水10份混合，室温5min灭活内源性酶。蒸馏水洗3次；暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶，37℃消化20min，原位杂交用PBS洗3次，每次5min，蒸馏水洗一次；后固定：1%多聚甲醛/0.1mol/LPBS(pH7.4)，含有1∶1000DEPC，室温10min，蒸馏水洗涤3次；预杂交：干的杂交盒底部加20%甘油2ml保持湿度，每张切片加预杂交液20μl，恒温40℃3h，吸取多余液体，不洗；杂交：按每张切片20μl杂交液，加在切片上，将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上，恒温箱40℃杂交过夜；杂交后洗涤：揭

8、掉盖玻片，用37℃水温的2×SSC、0.5×SSC、0.2×SSC分别洗涤5mi