探讨肺腺癌组织mrna在信号通路中的调控作用

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1、探讨肺腺癌组织mRNA在信号通路中的调控作用　　肺腺癌是肺癌当中最常见的一种，也是死亡率很高的一种癌症，通常5年生存率只有15%[1].通过对肺腺癌发生与进展中一些关键信号通路的研究，可以帮助寻找到高效的分子靶向抗癌药物。我们利用全基因组表达谱芯片，筛选肺腺癌与癌旁组织中差异表达的mRNA,并分析其参与的信号通路变化，探讨mRNA在信号通路中的调控作用。　　1材料与方法　　　　1.1标本　　　　所有6例肺腺癌组织标本均于2010年4月到2011年5月武汉大学中南医院胸心外科手术切除标本，所有病人标本均为术前未行放疗或化疗，术后病理确诊为肺腺癌的肿瘤组织

2、（T）和癌旁正常组织（N）的液氮冻存标本。所有标本采集均经过患者家属签属知情同意，并经医院伦理委员会审核通过。所有标本均于肿瘤离体后15min内获取。　　1.2一般材料　　　　TRIzol试剂（Invitrogen生命科技公司），ds-cDNA合成试剂盒（Invitrogen生命科技公司），单色DNA标记试剂盒（美国NimbleGen公司），含有19000条mRNA的全基因组表达谱芯片（上海康成生物技术公司）。　　1.3实验方法　　　　①RNA制备使用TRIzol试剂相位分离并提取组织总RNA.　　②RNA含量和质量控制：使用紫外光吸收测定法，利用Na

3、noDropND-1000测定RNA浓度和纯度。使用变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。　　③双链cDNA合成、洗脱及析出：使用Invitrogen试剂盒，按照说明书将提取的5μg总RNA合成为ds-cDNA.加入4μg的RNA酶A溶液，轻度振荡后在37℃下孵育10min,向含有RNA酶A的ds-cDNA中加入163μl苯酚∶氯仿∶异戊醇溶液，涡旋机上涡旋。将上述试剂转移到相位锁定管中，12000g下离心5min.　　小心转移上清液至干净的1.5ml离心管中，即得到无RNA的ds-cDNA.以冷无水乙醇析出沉淀并用NanoDropND

4、-1000定量。　　④样品标记：将1吸光度单位的Cy3-9荧光素加到1μg双链cDNA中，98℃下孵育10min.加入100pmoldNTP和100U克列诺片段并混匀，37℃孵育2h,加入0.1体积EDTA终止反应，异丙醇纯化已标记的ds-cDNA.　　⑤杂交和洗涤：取4μg已标记ds-cDNA加入Nim-bleGen杂交缓冲液，于42℃下在杂交系统中反应16-20h.之后用冲洗缓冲液洗涤。　　⑥扫描结果：AxonGenePix4000B扫描杂交后所得芯片，Gene-PixproV6.0读取原始图像。所得图像输入Nim-bleScansof

5、tRNA数据由AgilentGeneSpringGX软件进行进一步分析。对基因表达数据进行非监督分层聚类分析（UnsupervisedHierarchicalCluste-ring），并对基因进行信号通路分析。　　2结果　　　　2.1总RNA、ds-cDNA与标记DNA的质量与纯度　　　　通过NanoDropND1000分析，6组样品中总RNA、ds-cDNA与标记DNA的OD260/OD280Ratio值均在1.8-2.0之间，OD260/OD230Ratio值均大于1.8（表1）。琼脂糖凝胶电泳示总RNA的28S、18S条带清晰，且28S条带亮度在

6、18S条带的两倍以上，5S条带模糊。该结果显示所得RNA质量和纯度可满足实验要求，用于下步实验。　　　　2.2mRNA非监督分层聚类分析　　　　图1显示，依据mRNA的表达情况，6例标本被分为两大类，与肺癌组织和癌旁组织的分类相符，说明差异表达的mR-NA具有肿瘤组织特异性，即有大量的mRNA在肿瘤中发生了高表达或低表达。2.3mRNA在肿瘤组织中的差异表达情况==在mRNA火山图（图2）中，以T-test显着检验P值的负对数-log10（P-Value）为纵坐标，以log2（倍数变化）为横坐标。则图中红点表示在统计学上为差异表达2倍以上且P<0

7、.05的mRNA.　　检测后发现，发现发生显着差异表达（大于2倍变化且P<0.05）的mRNA共832条，其中T相对N高表达的mRNA407条。基因序号为NM-006926的mRNA在肿瘤中的表达量为正常组织中的58.69倍（P=0.026），序列号为NM-000900的mRNA在肿瘤组织中的表达量为正常组织中的43.69倍（P=0.026），序列号为NM-138455的mR-NA在肿瘤组织中的表达量为正常组织中的28.75倍（P=0.038）。表2列举了相对高表达的407条mRNA中的20条的情况。　　T相对N低表达的mR-NA有425条。其中

8、基因序号为NM-057182的mRNA在癌旁组织中的表达量为肿瘤组织中的17.49倍（P=0.