分析人工髋关节置换术后骨溶解及假体松动的分子生物

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1、分析人工髋关节置换术后骨溶解及假体松动的分子生物【摘要】目的探讨人工髋关节假体分离出的颗粒碎片刺激巨噬细胞而释放的肿瘤坏死因子(TNF-α)在人工髋关节术后引起骨溶解的作用机理。方法采用钛颗粒刺激巨噬细胞而释放TNF-α模型及酶联免疫吸附剂测定、蛋白质印迹、凝胶迁移率实验方法来研究其生物分子学机制。结果鼠类巨噬细胞受钛颗粒刺激而释放TNF-α，而JNK抑制剂SP600125和NF-кB抑制剂MG132大大抑制了钛颗粒诱导的TNF-α释放，但p38抑制剂无此作用，甚至，钛颗粒诱导巨噬细胞而激活AP-1和NF-кB。结论钛颗粒诱

2、导的TNF-α释放与JNK/AP-1及NF-кB通路有关。【关键词】人工髋关节置换术钛颗粒骨溶解肿瘤坏死因子【Abstract】ObjectiveTostudythemechanismofosteolysisaftertotalhipreplacementbytumornecrosisfactor-α(TNF-α)releaseinmacrophagesstimulatedprosthesis.MethodsAmodelofTNF-αreleasebystimulatingmacrophagesparticlesadeand

3、studythemechanismofTNF-αreleasebyElisa/SA.ResultsTNF-αurinemacrophagestimulatedbytitanium(Ti)particlesandspecificinhibitorsofJNK(SP600125)andNF-κB(MG132),butnotp38(SB203580)dramaticallyinhibitedTi-stimulatedTNF-αrelease.Moreover,transcriptionalactivationofAP-1andNF

4、-κBonstratethatTiparticle-inducedTNF-αreleaseismediatedthroughJNK/AP-1asble等已证明TNF-α可以增强成骨细胞NF-кB配位子（RANKLE）受体及巨噬细胞-集落刺激因子(M-CSF)受体活性［5］。而且，Ingham等发现TNF-α又直接促进早破骨细胞分化并激活成熟的破骨细胞吸收骨组织［6］。与此同时,Merkel等通过去除肿瘤坏死因子受体（TNFR）基因的动物颅骨与PMMA颗粒接触，发现无骨溶解现象［7］。这些结果显示，TNF-α是人工关节术后磨损

5、颗粒导致的骨溶解重要细胞因子。但至今,尚未报告与此相关的分子生物学机制。本次实验,通过鼠巨噬细胞受钛颗粒刺激而释放的TNF-α模型来分析TNF-α合成的分子生物学机制。1材料与方法1.1材料DMEM培养基，牛胎血清（FBS）来自于GibcoInvitrogen公司（Rockville.MD）。PD98059、SP600125、MG132来自于Calbiochem(LaJolaCA)。抗磷酸-ERK/JNK/IkBα抗体来自于CellSignalingTechnology(Beverly,MA)。测定鼠TNF-αELISA试剂

6、盒来自于BioSourceinternational(MadisonO)。硝基纤维膜及化学法光试剂盒来自于AmershanBiosciencesCorperation(Piscataa公司。1.2细胞培养RAEM培养基以及5％CO2湿润的37°C空气中，等生长到60%～70%后计数并培养在96孔培养皿（2×104细胞/孔）或60mm组织培养皿(2×106细胞皿)，然后，细胞与已知浓度的PD98059、SP600125、MG132处理30min后，再与钛颗粒处理。上清液及细胞收集后用于进一步分析。1.3钛颗粒准备钛颗粒（1～3

7、μm）来自于Cerac(MilulusAmebocyteLysate方法（Biol以后再倍比稀释至78pg/ml，即：10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、625pg/ml、312pg/ml、156pg/ml、78pg/ml。洗板3次，加入稀释好的酶标抗体，100μl/孔，37℃，1h。洗板3次，加入配好的ABTS显色液，100μl/孔，室温或37℃显色15～30min。ELISA读数仪测450nm/650nm处OD值，绘制标准曲线。1.4.2mol/LNaCl、1NP-40、0.5去氧胆酸及5

8、0mmol/LTris-HCl,pH8.0)中，室温下1h，离心10min(13000r/min)，取上清液，检测蛋白浓度。将同一蛋白浓度的待测标本、阳性对照及阴性对照样本煮沸3min，分别加入4%～15%十二烷基硫酸钠的聚丙烯酰胺凝胶，电泳45～60min(电压200V)。将带有蛋白带的