谈草珊瑚多糖对巨噬细胞raw264. 7 的免疫调节作用

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1、谈草珊瑚多糖对巨噬细胞RAW264.7的免疫调节作用草珊瑚又名肿节风，为金粟兰科植物草珊瑚的干燥全草。其性辛，味苦、平，归心、肝经。临床上用于治疗各种炎症性疾病、风湿关节痛、腰腿痛、疮疡肿毒肺炎、阑尾炎、急性蜂窝组织炎、肿瘤、跌打损伤、骨折等。现代药理研究表明草珊瑚具有抑制炎症反应，抗肿瘤，抗氧化，抗辐射损伤，抑制血小板降低等作用。草珊瑚多糖是草珊瑚中水溶性成分，是草珊瑚主要的抗炎成分之一。草珊瑚多糖可以增加巨噬细胞的一氧化氮(NO)的释放，也可以减少由于脂多糖(LPS)诱导的一氧化氮的分泌，可以增强巨噬细胞的吞噬功能。草珊瑚多糖有着抗炎的作用，但是对巨噬细胞的膜

2、蛋白的影响与因子的表达尚未见报道。本文通过研究草珊瑚多糖对巨噬细胞膜表面蛋白的表达的影响和细胞因子等mRNA的表达量，尤其对在炎性因子刺激下的M1巨噬细胞的影响，探讨草珊瑚多糖免疫调节作用机制，为开发草珊瑚多糖的物质基础做好基础，为临床的应用增加理论支持。　　1材料　　1.1细胞株小鼠巨噬细胞系RAEM培养基(批号NYA0793)、双抗(Gibco，批号J122751)、胎牛血清(FBS，批号GVJ0081)均购于Hyclone公司，TRIZOL试剂(Invitrogen公司，批号47303)，逆转录试剂盒(Thermo，批号00112927)，荧光定量PCR试剂

3、盒(罗氏，批号68298)，流式抗体:CD16/32-FITC(ABCCM，批号MCA2305FT)，CD14-APC(批号17014182)，CD40-PECY5，TLR4-PE(ebiscience批号129041)，大鼠IGg-FITC(ebiscience)，IFN-γ(Peprotech，USA(批号31505)，RatIgG2aKIsotypeControlPE(eBioscience)，RatIgG2aKIsotypeControlPE-Cy5(eBioscience)，RatIgG2aKIsotypeControlAPC(eBiosci

4、ence，批号MCA1125APC)，RatIgG2aKIsotypeControlFITC(eBioscience)(批号MCA1125FT)，异丙醇、无水乙醇、三氯甲烷(广州化学试剂厂)，LPS(Sigma)，一氧化氮(NO)检测试剂盒(Thermo，批号TB229)。　　1.4仪器二氧化碳恒温细胞培养箱(Thermo，USA)，细胞超净工作台(ESCO，USA)，ABI7500型实时荧光定量扩增仪(ABI，USA)，Cator7500型流式细胞仪(BeckmanCoulter，USA)，超速冷冻离心机(Beckman，USA)，全自动酶标仪(BIO-RAD，

5、USA)，紫外分光光度计(Thermo，USA)。　　2方法　　2.1草珊瑚多糖的制备根据谢勇等的报道，用水提醇沉的方法提取草珊瑚多糖，得到粗多糖，用相对分子质量3500的透析袋透析去除小分子盐类等物质。冷冻干燥得到精制的草珊瑚多糖。　　2.2对RATT孵育4h，然后加入DMSO150μL震荡10min，在波长570nm处检测吸光度(A)。　　2.3细胞培养与实验分组小鼠巨噬细胞株RAEM培养基培养，培养条件为:37℃，5%CO2。实验分组为:空白对照组，IFN-γ阳性对照组，LPS对照组，根据以上MTT结果和按照文献报道设定草珊瑚多糖低、中、高

6、剂量组，多糖终质量浓度分别为25，50，100mgL-1，草珊瑚多糖加IFN-γ组。　　2.4对巨噬细胞膜表面分子的影响巨噬细胞RA1模型后给予多糖干预，细胞膜蛋白CD40，CD14表达量增加，CD16/32表达量降低。　　3.3对巨噬细胞的IL-1β，IL-10，TNF-α，IL-6的基因mRNA表达影响RT-PCR检测基因的表达情况:结果(如表2)与空白对照组比较，草珊瑚多糖干预巨噬细胞后IL1-β，TNF-α，IL-10，iNOSmRNA的表达量都有不同程度的升高，统计学有意义。随着剂量的增加IL1-&

7、beta;，TNF-α，iNOSmRNA是不断增加的，有剂量依赖性，IL-10是随着剂量的增加是降低的，有统计学差异(P<0.01)。　　3.4对IFN-γ诱导的M1巨噬细胞6h的基因mRNA的影响草珊瑚多糖作用于IFN-γ诱导的M1型巨噬细胞，增加IL-1β，TNF-α，iNOS，IL-10mRNA的表达，有统计学差异。草珊瑚多糖可以增加M1型巨噬细胞的炎症因子和抗炎因子的表达。　　3.5对RA1巨噬细胞NO生成的影响剂量为25～100mgL-1草珊瑚多糖均能增加巨噬细胞NO的分泌，但是剂量依赖性不

8、强(P&l