丙氧鸟苷对转tk基因的人外周血单个核细胞的毒性作用

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1、丙氧鸟苷对转TK基因的人外周血单个核细胞的毒性作用　　摘要:目的探讨减少异体干细胞移植中移植物抗宿主病（GVHD），同时最大限度提高移植物抗白血病（GVL）效应的有效方法.方法采用逆转录病毒介导的基因转移方法将Ⅰ型单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）基因、绿色荧光蛋白（GFP）基因及抗新霉素（NeoR）基因插入人外周血单个核细胞（PBMC），MTT法测定丙氧鸟苷（GCV）对转化细胞抑制率.结果转化细胞表达GFP，且主要为T淋巴细胞，占11.4%，而且被转化的T淋巴细胞中，CD4阳性细胞转化率较高，占7.6%，CD8，CD

2、19，CD33阳性细胞转化率分别为2.9%，2.1%和4.7%.PCR鉴定表明，转染的人外周血单个核细胞DNA中整合有NeoR基因.MTT法测定丙氧鸟苷（GCV）对转化细胞与未转化细胞抑制率，显示转化细胞生长明显受抑.结论异体干细胞移植后，如产生严重GVHD应用GCV选择性清除HSV-TK基因转导的T淋巴细胞，使控制GVHD已成可能.　　Keyonocytes;gancicloir　　Abstract:AIMToexploretheia（GVL）effectmaximallyinallogeneichematopoiet

3、icstemcelltransplantation.METHODSViralthymidineki-nase（TK）gene，greenfluorescentprotein（GFP）geneandthebacterialneomycin-resistance（NeoR）geneanperipheralbloodmononuclearcells（PBMC）ajortransducedcellseoftheinfectedtargetcells，integratedNeoRgeneinatedTK-transducedTly

4、mphocyteincaseGVHDdevelopsispos-sible.　　0引言　　逆转录病毒载体介导的基因转移是近年发展起来的基因转移技术［1］.随着干细胞移植治疗恶性血液病的广泛深入，寻求减少移植物抗宿主病（GVHD），同时最大限度发挥GVL效应的方法是干细胞移植的重要课题之一［2］.我们以逆转录病毒载体介导将HSV-TK基因导入人外周血单个核细胞（PBMC），观察其表达及丙氧鸟苷（GCV）对转化细胞的毒性作用.　　1材料和方法　　1.1材料　　DMEM培养基（粉剂），由Gibco公司出品;rhIL-2购自北京

5、中化合通药业有限公司，批号960310;CD3mAb由军事医学科学院生产;PHA-P，噻唑蓝由Sigma公司出品，购自北京天象人生物工程公司;藻红素（PE）标记鼠抗人CD3，CD4，CD8，CD19，CD33mAb购自深圳晶美生物工程有限公司;GCV购自罗氏药业有限公司.PA317/GCGFPPT-SN为含GFP基因、HSV-TK基因、NeoR基因的逆转录病毒包装细胞株、NIH3T3细胞株，均由上海东方肝胆外科医院钱其军博士惠赠.　　1.2方法　　PA317/GCGFPPTSN包装细胞在含500mg・L-1

6、G418的DMEM中培养，培养条件为37℃，50mL・L-1CO2饱和湿化空气中培养.基本成层后，弃上清，换用无G418的新鲜培养液继续培养18～24h后，收集上清，以NIH3T3细胞株检测病毒滴度.病毒效价=集落数×上清稀释倍数（×103CFU・L-1）.取健康志愿献血者外周血5～8mL，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，用生理盐液洗2遍，悬浮于2mg・L-1PHA:10μg・L-1CD3mAb:5×105U・L-1rhIL-2和200mL&

7、#12539;L-1胎牛血清的DMEM培养中，置37℃，500mL・L-1CO2的饱和湿度培养箱中培养3～5d.取上述培养3～5d的PBMNC悬浮于8mg・L-1polybrene，100mg・L-1rhIL-2的病毒上清，孵育8～12h后，去除病毒上清及polybrene，加入含200mL・L-1胎牛血清的新鲜培养液，1～2d后，重复上述步骤，继续与病毒上清孵育、去除病毒上清、加新培养液，如此反复转染2～3次.转染病毒滴度与细胞比为10∶1.　　1.2.1倒置显微

8、镜观察　　取转染后细胞制成细胞悬液，相差镜头下观察，计数视野中细胞数，转换荧光光源，观察GFP所发出的绿色荧光，计数荧光细胞数.1.2.2FACS分析取转染细胞分加于6支试管，每管约2×105细胞，一管为阴性本底，其余5管分别用PE标记鼠抗人CD3，CD4，CD8，CD19，CD33mAb进行细胞表面抗原标记.参照检