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1、老年肺癌患者外周血单个核细胞hTERT基因表达【关键词】肺肿瘤Expressionofhumantelomerasereversetranscriptasegeneinperipheralbloodmononuclearcellsoflungcancerinelderlypatients 【Abstract】AIM:Toinvestigatethesignificanceoftheexpressionlevelsofhumantelomerasereversetranscriptase(hTERT)geneinperipheralbloodmononucl
2、earcellsoflungcancerinelderlypatients.METHODS:TheexpressionlevelsofhTERTalelderlysubjectsbyquantitativemeasurementRNAinthelungcancerpatients(0.927±0.115)alsubjects(0.408±0.124,P<0.001),easurementRNAisaneffectivemethodinthediagnosisoflungcancerinpatientsinations. 【Keys;humantelo
3、merasereversetranscriptase;geneexpression 【摘要】目的：探讨外周血单个核细胞(PBMCs)的人端粒酶反转录酶(hTERT)基因的表达水平对于老年肺癌的诊断意义.方法：采用RTPCR定量检测20例老年肺癌患者及10例正常老年人外周血单个核细胞的hTERT的基因表达水平.结果：老年肺癌患者hTERTmRNA的水平明显高于正常对照组（0.927±0.115vs0.408±0.124,P<0.001）.与病理类型与临床分期无相关性.结论：定量测定PBMCs的hTERTmRNA的表达水平是诊断不适合其他检查的老年肺癌患
4、者的有效方法. 【关键词】老年人；肺肿瘤；人端粒酶反转录酶；基因表达 0引言 老年疑似肺癌患者的明确诊断一直是长期困扰临床医生的实际问题.端粒酶可作为一种肿瘤标记物已在多组研究中被证实.我们研究的目的是探讨外周血单个核细胞(PBMCs)的人端粒酶反转录酶(hTERT)基因的表达水平对于老年肺癌的诊断意义. 1对象和方法 1.1对象 200201/200412我院住院的老年肺癌患者20例，男15例，女5例，年龄61~82（70±6）岁.患者依据病史、临床表现、XRay胸片、肺CT，纤支镜、癌细胞学及病理学确诊（Tab1）.正常对照10例，均为来我院
5、健康体检者，男7例，女3例，年龄62~81（71±5）岁，经健康检查均除外各种恶性肿瘤. 1.2方法 1.2.1标本采集两组人群于清晨06：0007：00空腹未起床活动时，平卧位采取右肘静脉血3mL，肝素抗凝,加入等量的PBS液稀释混均，加至5mL淋巴细胞分离液上，4℃离心（2000r/min,15min），吸取中间层单个核细胞，-80℃保存待检测. 1.2.2总RNA提取上述细胞利用总RNA的提取系统(II)(totalRNAExtractionsystemII,华美生物工程公司)来提取总的RNA，实验步骤按说明书进行.将沉淀的RNA进行干燥，用无R
6、Nase污染的水将RNA溶解，在A260280测吸光值，要求A260/280≥2.0并计算出RNA含量，并用其合成cDNA. 1.2.3引物构建端粒酶hTERT引物从LterGenBank中调出hTERTmRNA全基因系列，采用primer5.0计算机软件设计引物，上游引物5′TATGCCGTGGTCCAGAAGG3′,下游引物5′GCGTGGGTGAGGTGAGGTCT3′,扩增长度为328bp.内参照(βactin)上游引物为5′GATTGCCTCAGGACATTTCTG3′,下游引物5′GCGTGGGTGAGTGAGGTCT3′,扩增片段长度为690
7、bp,引物由北京奥科合成. 1.2.4cDNA合成应用RTPCR试剂盒（大连宝生物有限公司）逆转录合成cDNA.每个反应体系中加入总RNA1μL,2×buffer5μL,MgSO42μL,dNTPs0.5μL,AMV(逆转酶)0.5μL,oligodT150.5μL,RNasEinhibitor0.25μL,dd.H2O0.25μL.将上述反应物放入PCR仪(BIOMETRA型)65℃1min→30℃5min,30℃至65℃15→30min匀速升温，65℃30min→98℃5min→5℃5min，合成好的cDNA存于-20℃备用.1.2.5内参照定量PCR
8、在PCR反应体积中，吸取cDNA1μL;dd.H2O
