小鼠精子畸形试验研究饮水砷的遗传毒性

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1、小鼠精子畸形试验研究饮水砷的遗传毒性砷是广泛分布于自然界中的非金属元素，环境中的砷主要通过水体转运进入人体。地方性砷中毒是一种典型的因长期饮用高砷水（国家标准<0.05mg/L）造成的中毒性疾病。水砷是人群暴露的主要途径，饮水砷主要以无机砷的形式存在，无机砷进入机体后的代谢过程十分复杂，经过二次氧化甲基化和二次还原过程[1],被催化生成五价二甲基砷（DMA5+）[2],最终代谢物对机体产生损伤作用。流行病学研究表明，慢性饮水型高砷暴露与心血管系统、神经系统疾病，糖尿病以及多组织器官恶性肿瘤的发生密切相关[3].我国饮水型高砷暴露地区

2、主要分布在内蒙古、山西、新疆等地[4].目前大部分研究主要涉及地方性砷中毒监测、砷在头发、血液、尿液等样品含量的测定，慢性砷暴露可诱发恶性肿瘤、肺癌等相关研究也有个别报导，但饮水砷暴露对机体遗传损伤毒性作用研究较少见。本研究通过Ames试验、小鼠骨髓细胞微核试验和小鼠精子畸形试验研究饮水砷的遗传毒性，了解其发生原因与作用机制，为饮水型砷中毒的防治与监控提供科学的理论依据。　　　　1材料与方法　　　　1.1材料　　　　1.1.1试验菌株、动物鼠伤寒沙门氏菌株TA97、TA98、TA100、TA102为实验室冻存菌株。本实验室对菌株特性进行鉴

3、定，符合Ames试验标准。SPF级健康昆明种小鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号：SCXK（京）2012-0001;饲料于北京科澳协力饲料有限公司，饲料合格证号：SCXK（京）2009-0012;动物房屏障系统使用许可号：SYXK（蒙）2010-0001.　　　　1.1.2受试物和主要试验试剂　　　　1.1.2.1受试物准确吸取一定量的砷标准溶液，用无菌蒸馏水定容到450μg/L,依次稀释成不同浓度。　　　　1.1.2.2主要试验2,4,7-三硝基-9-芴酮和叠氮钠（Fluka公司）、MMS（Merck公司）、2-

4、AF和1,8-二羟基蒽醌（上海试剂厂）、氧化型辅酶Ⅱ、6-磷酸葡萄糖钠盐、L-组氨酸（Sigma公司）、生物素（Sigma公司）、S9（本实验室按Ames方法制备，液氮保存，批号20130713）、胎牛血清、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、甲醇、环磷酰胺、Giemsa染液。　　　　1.2方法　　　　1.2.1Ames试验采用鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA98、TA100、TA1024种菌株，体外活化系统为多氯联苯诱导的大鼠肝均浆制备的S9混合液。选用菌株TA100进行预试验，计数每个平皿中的回变菌落数。将无菌蒸馏水定容到450μg/L的砷标准

5、溶液作为受试样品，用无菌蒸馏水稀释到不同浓度，检测剂量分别设定为0.0450μg/皿、0.0150μg/皿、0.0050μg/皿、0.0017μg/皿、0.0006μg/皿。设空白对照、溶剂对照和阳性对照，不同菌株使用不同的阳性致畸物。溶剂对照为100μL/皿的无菌蒸馏水，在加和不加S9的试验条件下进行平板渗入法试验；每组设3个平行样品，实验重复1次。　　　　1.2.2小鼠骨髓细胞微核试验选用SPF级健康昆明种小鼠50只，体重25~30g、平均体重26.02g,按体重随机分为5组，每组10只，雌、雄各半

6、。受试物组剂量分别为0.09μg/kg、0.03μg/kg、0.01μg/kg,阴性对照组给蒸馏水，阳性对照组经口给予环磷酰胺40mg/kg,灌胃量为0.2mL/10g.采用30h给受试物法，两次给受试物间隔24h,于第2次灌胃6h后颈椎脱臼处死小鼠，取胸骨骨髓涂片、固定、染色、镜检。每鼠计数1000个嗜多染红细胞（PCE）的微核细胞数，观察200个PCE,计数同时观察到的正染红细胞（NCE）数目，计算PCE/NCE比值。　　　　1.2.3小鼠精子畸形试验选用雄性昆明种小鼠25只，体重25~35g、平均体重30.58g,

7、按体重随机分为5组，每组5只，设3个剂量组，剂量分别为0.09μg/kg、0.03μg/kg、0.01μg/kg,另设溶剂（蒸馏水）对照组和环磷酰胺阳性对照组（40mg/kg）。经口灌胃1次/d,灌胃量均为0.2mL/10g,连续灌胃5d,于首次给受试物后第35d脱颈椎处死动物，取双侧副睾制片，按《食品安全性毒理学评价程序和方法》GB15193.7-2003中的规定，经甲醇固定、1%伊红染液染色后，于高倍镜下对每只小鼠计数1000条完整精子，记录精子畸形数、畸形类型，计算精子畸形发生率。　　　　1.2.4数据处理试验数据

8、使用SPSS13.0统计软件进行χ2检验。　　　　2结果　　　　2.1受试物对鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型回变菌落数的影响计数每个平皿中的回变菌落数，在加或不加体外代谢活化系统S9时，受