n乙酰氨基半乳糖转移酶2对胃癌细胞sgc7901黏附迁移能力的影响

《n乙酰氨基半乳糖转移酶2对胃癌细胞sgc7901黏附迁移能力的影响》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、N乙酰氨基半乳糖转移酶2对胃癌细胞SGC7901黏附迁移能力的影响【关键词】N乙酰氨基半乳糖转移酶2（ppGalNAcT2）胃癌细胞SGC7901黏附迁移［Abstract］Objective:ToinvestigatePolypeptide：Nacetylgalactosaminytransferases2（ppGalNAcT2）′sroleduringadhesionandmigrationofgastriccancercellSGC7901.Methods：TotransfectppGalNAcT2plussensevector（pEGFPC1T2），

2、vacuityvector（pEGFPC1）andinterferencevector(pSilenCircle)toSGC7901.I1640液稀释细胞，37℃孵育30min，其间充分振荡以防细胞凝集。将上述细胞悬液分别接种于已包被的板内,5×104个细胞(0.5ml/孔)，于37℃中保温，30，60和90min时弃去未黏附细胞，用PBS液轻洗2遍。0.25%胰酶消化后收集黏附细胞计数，黏附百分率=黏附细胞数/总细胞数×100%。1.2.5穿膜实验包被基底膜：用50mg/L基质胶1∶8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃风干。每孔加入50μl含10g/L

3、BSA的无血清培养液，在下室面铺纤连蛋白，将200μl枪头的尖端剪掉,吸取纤连蛋白均匀涂抹在小室的下面。用无血清培养基培养细胞12～24h，使细胞处于饥饿状态。收集细胞，用PBS洗1～2遍，台盼蓝染色检测细胞活力达95%以上，用含BSA的无血清培养基重悬，调整细胞密度至1×105。取细胞悬液200μl加入Transwell小室，24孔板下室加入500μl含FBS的培养基，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。培养细胞：常规培养8～12h。用棉签擦去基质胶和上室内的细胞，苏木精染色、伊红染色等。细胞计数：把Transwell小室反过

4、来底朝上就可清楚看到小室底膜上下室侧附着的细胞。取有固定的位置15个视野计数细胞个数。1.2.6统计学分析采用SPSS13.0统计软件包进行统计。数据用±s表示，两组计量资料均数比较呈正态分布且方差齐时用t检验，如非正态分布和（或）方差不齐时用秩和检验，P<0.05表示差异有统计学意义。2结果2.1胃癌SGC7901细胞正义和空载体真核表达载体亚细胞株的构建带有GFP的正义载体pEGFPC1T2和空载体pEGFPC1成功转入胃癌SGC7901细胞中，可以看到明显绿色荧光（图1）；而没有转染GFP的对照组和干扰组在荧光显微镜下则看不到绿色荧光。2.2蛋白质印迹鉴定

5、干扰载体的转染情况RNA干扰真核表达载体转染细胞后无荧光发出,通过蛋白质印迹检测ppGalNAcT2的表达情况。从图2可以看出，SGC7901干扰组ppGalNacT2的表达比其他组低，同时也证明干扰载体被转染。从图4可以看出，转染正义载体组ppGalNAcT2的亚细胞株突破胶滴的细胞数明显少于干扰组,干扰组的细胞突破胶滴后贴壁并开始增殖。2.5各亚细胞黏附百分率4组亚细胞在不同时间点对细胞外基质的黏附能力不同，差异有统计学意义（P<0.05），见表1～3。表1基质胶黏附百分率表2透明质酸黏附百分率表3纤连蛋白黏附百分率综合3个表的结果，SGC7901T2细

6、胞对细胞外基质成分的黏附能力下降，而SGC7901干扰细胞对细胞外基质成分的黏附能力上升。2.6穿膜实验HE染色记数穿膜实验中分别在24孔Transucin）［1］。大多数黏蛋白的主要用途是为暴露在环境中的表面保存水分。但是，这些表面未能像皮肤的表面一样被不透水层密封住。因此，黏蛋白必定会出现在消化道、生殖泌尿道和呼吸系统表面。在丝氨酸和苏氨酸残基上添加唾液酸化的聚糖簇群，导致形成强负电荷区，使黏蛋白结合大量水分子。由于其高度水和结构，从黏蛋白释放水分消耗能量，因而降低了蒸发速度［2］。随着许多新的O糖基转移酶被发现，人们对它们的功能也开始有了新的认识。O糖基化产生的

7、糖链结构复杂性远高于以往发现的N聚糖，从而决定了其功能的多样性。已经有人提出，O糖基化可能与肿瘤的发生发展密切相关［3］。ppGalNAcT2是O糖基化的起始酶，故推测其在肿瘤的发生、发展过程中起重要作用。随着ppGalNAcT2的上调表达，SGC7901细胞增长速度降低，与TGFβ1呈负相关。ppGalNAcT2这种作用与以前本实验室的研究结果相一致。杨静等［4］在研究全反式维A酸对HL60细胞株三种糖基转移酶家族表达的影响时发现，加入全反式维A酸后HL60细胞株中ppGalNAcT2表达量急剧增加