大鲵肺肾囊肿病原大鲵虹彩病毒调查

《大鲵肺肾囊肿病原大鲵虹彩病毒调查》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、大鲵肺肾囊肿病原大鲵虹彩病毒调查　　大鲵(Andriasdavidianus)属两栖纲有尾目(Caudata)隐鳃鲵科(Cryptobrachidae)大鲵属(An-drias),俗称娃娃鱼.大鲵是世界上现存的个体最大的两栖类爬行动物,属于国家二类野生保护动物,已被列入CITES公约附录Ⅰ中.自1978年报道首例大鲵人工繁育成功以来[1],我国许多有大鲵自然分布的地区都积极开展了大鲵的人工繁育和养殖.然而,随着大鲵养殖规模的不断扩大以及集约化程度的提高,有关大鲵养殖病害的报道逐年增加.研究表明,养殖大鲵病害的病原主要包括细菌、病毒及寄生虫等[2-4].2010年以来,陕西省汉中、商洛等地区

2、养殖大鲵发病,死亡率达90%以上.病鲵主要临床症状包括体表溃疡、局部有出血点以及后肢和头部肿大等.　　尸体剖检后发现病鲵肺脏、肾脏表面出现多处大小不一的囊性病变,其他病变不明显.为查明引起病鲵肺脏、肾脏囊肿的病原,无菌条件下分别从病鲵肝脏、肺脏、肾脏等部位分离细菌性病原,从肝脏分离到一株弗氏柠檬酸杆菌,肺脏和肾脏未分离到致病菌.将自然发病大鲵的内脏组织固定后进行了病理组织切片和超薄切片观察,并在此基础上进行了分子生物学研究,综合试验结果判定引起病鲵肺脏、肾脏囊肿的病原是大鲵虹彩病毒.现将研究结果详细报道如下,希望对于大鲵疾病的临床诊断和防控提供一定的参考.　　1材料与方法　　1.1材料　　

3、病鲵采自陕西省汉中、商洛等地的大鲵养殖场,体质量2.0kg~3.5kg;脑心浸液(BHI),北京陆桥生物制品有限公司产品;25g/L戊二醛,Sigma公司产品;Amp,天根生化科技(北京)有限公司产品;ExTaqDNA聚合酶、dNTPs、MarkerDL2000,病毒DNA提取试剂盒、MiniBESTPlasmidPurificationKit、AgarosegelDNAFragmentPurificationKit、T4DNA连接酶、感受态细胞DH5α,宝生物工程(大连)有限公司产品;pMD18-Tsimple载体,Pro-mega公司产品;其他试剂均为国产分析纯.　　1.2

4、方法　　1.2.1细菌分离与鉴定　　取症状典型的濒死大鲵,参照文献[5]的方法以无菌操作从肝脏、肺脏、肾脏取样进行BHI平板划线分离,置30℃培养,24h后观察.待菌落形成后进行纯化,然后将纯培养物按说明书操作利用全自动微生物鉴定仪(Biolog,Om-ilogGEN,USA)进行细菌鉴定.　　1.2.2组织病理切片制备与观察　　取病鲵的肝脏、肾脏、肺脏等组织,用Bouin液固定24h,酒精梯度脱水,二甲苯透明,石蜡包埋、切片,HE染色,光镜观察.　　1.2.3超微切片制备与观察　　取病鲵的肝脏、肾脏、肺脏等组织,切成1.0mm3大小的小块,经25g/L戊二醛固定,乙醇脱水,环氧树脂包埋,

5、用LeicaCM1950超薄切片机制备厚度为50nm~80nm的超薄切片,置于有支持膜的铜X上,醋酸铀及柠檬酸铅染色后在H-7650型透射电镜80kV下观察.　　1.2.4基因扩增与序列测定　　将处理后的病鲵肝脏、肺脏、肾脏等组织按照病毒核酸提取试剂盒说明书进行病毒核酸的提取.根据GenBank已发表的蛙病毒属的代表种FV3主要衣壳蛋白(mcp)基因高度保守区序列(GenBank登录号:AY548484),应用Primer5.0和Oligo6.0设计一对引物,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成.引物序列如下:P1:5′-CCGATGTCTTCTGTAACTGGTTC-3&p

6、rime;;P2:5′-CCCTTACAAGATTGGGAATCCCA-3′.以提取纯化的病毒DNA为模板进行扩增,总体积为25μL的反应体系为:0.25μLTaKaRaExTaq(5U/μL),2.5μL10ExTaqbuffer(Mg2+Plus),0.25nmol/LdNTPs1.0μL,引物(50pmol/L)各0.5μL,DNA模板3μL,ddH2O补充至25μL.反应条件为:95℃3min;95℃30s,52℃30s,72℃1.5min,30个循环;72℃充分延伸10min.10g/L的琼脂糖凝胶电泳检测P

7、CR产物.经PCR反应获得的目的基因通过胶回收试剂盒回收后,按10μL反应体系,依次加入纯化PCR反应产物4μL,pMD18-Tsimple载体1μL,连接缓冲溶液5μL.16℃连接2h,取连接产物转化DH5α感受态细胞,涂布含Amp的LB平板,37℃培养12h~16h后,挑取5个~6个白色菌落抽提质粒,PCR扩增挑选阳性克隆.阳性克隆委托北京天一辉远生物科技有限责任公司测序.测序结果