正文描述:《apc基因及其在宫颈癌病变中的蛋白表达情况研究》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在应用文档-天天文库。
1、APC基因及其在宫颈癌病变中的蛋白表达情况研究 宫颈癌是严重威胁女性生命的第二大恶性肿瘤,在女性的恶性肿瘤中,其死亡率居妇女恶性肿瘤之首。据估计,全球每年大约有529800例宫颈癌新增病例[1],我国每年约有lO万宫颈癌新发病例,并已成为导致我国女性死亡的第三大因素[2]。 宫颈癌的发生发展是一个多因素、多步骤的长期过程,其中涉及多个基因的改变而引发细胞的异常增殖,导致宫颈癌发生。20世纪90年代中期,大量的流行病学研究和分子生物学研究已经证实,人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)感染是宫颈癌及宫
2、颈上皮内瘤样病变(cervicalintraepithelialneoplasia,CIN)发生的重要因素,持续的HPV感染,是女性发生宫颈鳞癌的必要条件[3]。腺瘤性结肠息肉病(adenomatouspolyposiscoli,APC)基因是由Herrera等[4]于1986年首次发现并由Kinzler和Groden等[5]首先分离出来,APC基因直接参与ax医用核酸分子快速杂交仪(凯普生物化学有限公司提供),PCR反应试剂盒、DL2000DNAMarker(大连宝生物工程有限公司),M-MulvReverseTranscr
3、iptase(Promega公司),兔抗人多克隆、兔抗人APC单克隆抗体(北京中衫生物技术有限公司),免疫组化SP试剂盒(DAKOenvi-sionDenMar)、DAB显色试剂盒(福州迈新生物技术有限公司)。 1.3实验方法 1.3.1标本采集及处理取3组手术患者宫颈移行带组织,组织离体30min内用无菌Ep管盛装,放入-80℃冰箱保存。 1.3.2宫颈组织中APCmRNA的表达取宫颈组织100mg放入研磨钵液氮下研充分磨,将匀浆液倒入1.5mL离心管室温放置5min,按RNA提取试剂盒提取总RNA,取适量RNA样品,
4、用核酸蛋白定量仪测定A260/A280值和浓度。反应体系25μL。APC引物序列:上游引物为5'-TGAG-GAATTTGTCTTGGCGAG-3',下游引物为5'-GCACTTCCCATAGCAATCATT-3',扩增产物长度为526bp。β-actin引物序列:上游引物为5'-CT-GTCTGGCGGCACCACCA-3',下游引物为5'-GCAACTAAGTCATAGTCCGC-3',扩增产物长度为254bp。PCR反应条件:预变性94℃3m
5、in,变性94℃30s;退火(复性)55℃30s,延伸72℃40s,APC基因循环35次,β-actin循环28次,最后1次延伸72℃10min。PCRMarkersD2000(内含指示剂)4μL点样于第1孔,PCR产物8μL,适量0.5TBE电泳缓冲液,混匀后依次点样于其后各孔,在1.0%琼脂糖上进行凝胶电泳。应用凝胶成像系统摄取各样本电泳图,将有条带显示的标本视为阳性表达。 1.3.3宫颈组织中APC蛋白的表达组织块10%中性甲醛固定后,石蜡包埋、切片,切片厚度约4μm,每例选取5张,1张用P
6、BS缓冲液代替一抗,作为阴性对照,其余行APC免疫组化染色。石蜡切片65℃烤片、脱蜡、水化,放入3%H2O2中,37℃孵育20min,PBS振洗,热修复抗原,滴加适量正常牛血清封闭液,室温孵育10min;PBS振洗两遍后加封闭液,37℃孵育30min,加1∶100的一抗(兔抗人APC多克隆抗体),阴性对照用PBS代替一抗。37℃孵育30min,4℃冰箱过夜;滴加二抗SP(辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素)37℃孵育15min,DAB显色,苏木精轻度复染;梯度酒精脱水,透明,封片;阅片、拍照,高倍镜下观察结果。以细胞浆着色为黄色或
7、棕黄色判定为APC蛋白阳性目标,PBS代替一抗为阴性对照。每例均随机在高倍镜下观察5个视野(放大400倍),计数阳性细胞的个数,每个高倍视野计数3次,以其算术平均值作为阳性细胞的个数。计数方法:阳性着色细胞数≥10%为阳性表达,阳性着色细胞数<10%为阴性[9]。 1.3.4宫颈组织中HPV16DNA的表达取1μLDNA进行HPVPCR扩增,反应体系25μL(DNA1μL将PCR-Mix23.25μL、Taq酶0.75μL)。PCR条件95℃预变性9min,95℃变性20s,55℃退火30
8、s,72℃延伸30s,循环40次。取20μLPCR产物进行杂交实验;在反应槽内加入1mL预热至45℃的杂交液,温育2~5min;将之前制备好的已变性DNA样品溶液加入0.5mL预热至45℃的杂交液中,混匀,然后加上薄膜,温育10min后,进行导流杂交;45℃条件下,用预
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